一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种β‑葡萄糖苷酶基因。所述β‑葡萄糖苷酶基因从土壤总DNA中获取，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明专利技术的β‑葡萄糖苷酶不需要利用表面展示或者信号肽表达的技术就可直接使菌体利用纤维二糖，从而进行丁二酸的生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)属于水解酶。它可以水解并且结合末端、非还原性的β-D-葡萄糖及相应配基。该酶可以将纤维二糖或短链葡聚糖水解成葡萄糖。因其参与纤维素水解的最后一步，所以常被认为是纤维素水解糖化过程的限速酶。β-葡萄糖苷酶按照氨基酸序列可以划分为糖苷水解酶家族1和糖苷水解酶家族3两类。糖苷水解酶家族1中的酶主要来源于细菌、植物和哺乳动物；糖苷水解酶家族3中酶来源于真菌、细菌和植物。可见其来源比较广泛。β-葡萄糖苷酶一般通过表面展示和信号肽表达的方式达到在胞外分解纤维二糖为葡萄糖，以此供给细胞利用生长，目前尚未有β-葡萄糖苷酶不需要通过表面展示或者信号肽表达就可以利用纤维二糖生长的报道。
技术实现思路
本专利技术的技术目的之一，在于提供一种来自土壤总DNA的β-葡萄糖苷酶基因，所述的土壤总DNA采集自南京工业大学东操场边上小花园附近。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术所述的β-葡萄糖苷酶基因，来源于南京工业大学东操场边上小花园附近土壤总DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述的β-葡萄糖苷酶基因是通过构建土壤总DNA的基因组文库，经过一系列酶切、酶连、转化等手段获得所需的阳性克隆，提取阳性克隆质粒测序，获得β-葡萄糖苷酶核苷酸序列。再根据所得到序列设计引物通过PCR即获得目的基因。优点是方便快捷效率高。为获得本专利技术所述β-葡萄糖苷酶基因，具体步骤为：(1)样品采集：土壤样品采自南京工业大学东操场边上小花园附近。(2)土壤总DNA的提取：称取1g土壤样品，加入1mL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸缓冲液和玻璃珠，振荡1min，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最终浓度为2.5mg/mL，室温振荡15min，放置冰箱30min，加125μL 20％SDS振荡处理15min后离心，加酚(1:1体积)抽提1次，氯仿-异戊醇(1:1体积)抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h，离心，70％乙醇清洗，30μL TE溶解。(3)构建土壤总DNA的基因组文库：用限制性内切酶EcoRI将总DNA部分酶切，再经琼脂糖凝胶电泳分离回收2-3kb的DNA片段，与脱磷载体pUC118(BamHI/BAP)(TaKaRa，Code:D3321)连接后，化学转化导入制备好的E.coli DH5α感受态细胞，构建基因组文库。限制性内切酶EcoRI酶切总DNA体系为：总DNA15μL，10×buffer H 3μL，EcoRI 3μL，加双蒸水调至总体积30μL。37℃酶切30min。加入3μL 10×loading buffer终止酶切反应。酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收2-3kb DNA片段。回收按照试剂盒说明书进行。酶切片段与脱磷载体pUC118(BamHI/BAP)的连接：将1μL pUC118(BamHI/BAP)载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入6μL总DNA的EcoRI酶切回收片段，加水至8.5μL，于45℃加温5min使重新退火的粘端解链，将混合物冷却到0℃。然后加入1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液，0.5μL T4DNA连接酶。16℃连接反应12h以上。(4)酶连产物的转化和获取阳性克隆：将10μL酶连产物加入到200μL在冰上融化后的E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后，快速转移到冰浴中冷却1～2min，向每管中加入800μL液体LB培养基，37℃摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μL感受态细胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上，平板倒置于37℃培养箱培养，12-16h后出现菌落，选择有天然变色的克隆子，即为含β-葡萄糖苷酶基因片段的阳性克隆子，同时对阳性克隆子进行编号。挑单菌落接种于5mL LB液体试管，待长出菌悬液后提质粒验证。(5)提取阳性克隆质粒测序，获取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：阳性克隆子插入片段的测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序引物为pUC118(BamHI/BAP)载体上特异性引物，并根据两端测序结果设计引物，直至将整个插入片段测通。将测序完成的序列在NCBI数据库中进行比对，并利用ORF finder工具鉴定插入片段所含的ORF。(6)引物的设计与合成：根据测序结果的基因序列设计PCR引物，引物设计如下：设计长度为50mer左右的引物，该引物分为两个部分，P1的第一部分是上游载体末端同源序列，第二部分是基因特异性正向扩增序列。P2的第一部分是基因特异性反向扩增序列，第二部分是下游载体末端同源序列。利用PCR进行β-葡萄糖苷酶基因扩增，在50μL反应体系中，P1、P2两个引物的添加量为1μL，扩增条件为：94℃预热10min；94℃，45s；60℃，45s；72℃，2.5min；72℃，10min，中间三步共30个循环，使用的DNA聚合酶为2×Phanta@Master Mix酶(诺唯赞公司，中国)。PCR结束后，1.5％琼脂糖胶回收片段，测定浓度。同时对于表达载体pET-28a(+)用限制性内切酶EcoRI酶切线性化，1.5％琼脂糖胶回收片段，测定浓度。计算最适克隆载体使用量(＝0.02×克隆载体碱基对数)ng和最适插入片段使用量(＝0.04×插入片段碱基对数)ng(例
如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02×5000＝100ng；插入片段最适使用量应为：0.04×2000＝80ng)。利用One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞公司)进行重组反应。37℃反应30min后转化到DH5α感受态中。获得长度为2775bp的SEQ ID NO：1序列的阳性克隆，即为本专利技术的β-葡萄糖苷酶基因。本专利技术还提供了一种重组载体，所述重组载体含有上述的β-葡萄糖苷酶基因。本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组载体。所述宿主细胞可为原核细胞。所述原核细胞可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。为实现上述技术目的，具体可采用如下技术方案：将上述SEQ ID NO：1序列直接与原核表达载体pET-28a(+)连接，37℃反应30min。将该载体转化感受态大肠杆菌DH5α。将菌液涂布在含30μg/mL卡那霉素霉素的固体LB培养基(2％蛋白胨，1％酵母粉，1％NaCl，1～2％琼脂)培养后获得单菌落。挑取单菌落用5mL液体LB试管培养过夜，提质粒，进行单双酶切验证。选取验证正确质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将菌液涂布含30μg/mL卡那霉素的固体LB培养基培养后获得单菌落。本专利技术还提供了本专利技术所述β-葡萄糖苷酶基因在生产丁二酸中的应用。本专利技术的β-葡萄糖苷酶是一种新型β-葡萄糖苷酶，它是一类应用非常广泛的生物酶类。通过对该基因的原核表达和纯化，可以应用于该酶的工业化生产中。本专利技术的β-葡萄糖苷酶不需要利用表面展示或者信号肽表达的技术就可直接使菌体利用纤维二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑葡萄糖苷酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基因。3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜岷，薛梦蕾，董维亮，马江锋，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32