一种β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用。所述β‑葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4，最适作用温度为50℃，且在30℃‑60℃范围内能保持80％以上的酶活，耐热性比野生型更强；最适作用pH为5.0，且在pH3.0‑6.0范围内能保持70％以上的酶活，在酸性条件下的适用范围比野生型更宽泛，因此更加有利于其在纤维素原料降解过程中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因筛选改造
，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶(cellobias，CB或β-G)和苦杏仁苷酶。它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物，是地球上最丰富且可再生的资源。据估计，地球上每年光合作用产生1.5×1011亿吨纤维素(Ryu，D.D等，1980，Enzyme and Microbial Technology)。多数情况下，要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。自然界中产纤维素酶的生物很多，主要是微生物，如丝状真菌、细菌和放线菌等。因此，对产纤维素酶微生物的筛选或遗传改造研究及应用就受到了普遍的关注。一般认为，纤维素类物质经酶促作用生成葡萄糖至少需要三种酶：内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶把纤维素先降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纤维素酶主要是通过这三种酶协同作用，最后将纤维素转化为葡萄糖。在这个过程中β-葡萄糖苷酶起到关键作用。而在纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，成为纤维素酶解的瓶颈。因此,通过基因重组技术构建工程菌,分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。为此，已经有很多种β-葡萄糖苷酶基因被构建到不同的工程菌中。而开发性能更加优良的β-葡萄糖苷酶，并提高其表达量依然是本领域的研究热点之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。本专利技术通过大量突变的筛选，最终获得一种耐热性更强、在酸性环境下适用范围更宽泛的突变体，并构建得到了重组表达该突变体的里氏木霉工程菌株，为实现其应用奠定了基础。本专利技术一方面涉及一种β-葡萄糖苷酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由Leu变为Ile，第133位氨基酸由Tyr变为Phe，第222位氨基酸由Asn变为Gly，第579位氨基酸由Ile变为Leu，第676位氨基酸由Gln变为Phe。上述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。本专利技术另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO：4的β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组质粒。本专利技术还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。所述工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。本专利技术还涉及一种纤维素酶，是由上述里氏木霉发酵制备得到的。本专利技术经过大量筛选获得了一种新型β-葡萄糖苷酶突变体，该突变体的最适作用温度为50℃，且在30℃-60℃范围内能保持80％以上的酶活，耐热性比野生型更强；最适作用pH为5.0，且在pH3.0-6.0范围内能保持70％以上的酶活，在酸性条件下的适用范围比野生型更宽泛，因此更加有利于其在纤维素原料降解过程中的应用。附图说明图1：SDS-PAGE电泳检测图，其中泳道1为里氏木霉宿主菌发酵上清液，泳道2为里氏木霉TR-BG发酵上清液，泳道3为里氏木霉TR-BG5发酵上清液，箭头所指处为95KDa；图2：β-葡萄糖苷酶野生型与突变体相对酶活-作用温度曲线图；图3：β-葡萄糖苷酶野生型与突变体相对酶活-作用pH曲线图。具体实施方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。实施例1β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其突变体的构建1.1提取烟曲霉总基因组DNA将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，250mM NaCl，1％SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。1.2基因克隆以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物BG-F和BG-R进行PCR扩增：BG-F：AAAGGTACCATGAGATTCGGTTGGCTCGAGG；BG-R：AAATCTAGACTAGTAGACACGGGGCAGAGG；PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；58℃30S，72℃3min30个循环；72℃，7min；凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。1.3表达载体构建将1.2中的PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI和KpnI进行酶切；同时，用限制性内切酶XbaI和KpnI对木霉表达载体pTG进行酶切；使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶将上述两个酶切产物连接；将连接产物转化进DH5a大肠杆菌，用氨苄青霉素进行选择。通过对所获得的克隆进行测序可知，上述PCR扩增产物的基因序列为SEQ ID NO:2(命名为TR-BG)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经NCBI BLAST序列比对发现，SEQ ID NO:1与来源于烟曲霉的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列相似性为100％。使用质粒中量制备试剂盒从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化重组质粒，该质粒命名为pTG-TR-BG。1.4突变体的获得申请人为了进一步提高上述β-葡萄糖苷酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)的耐热性，以1.3中构建得到的重组质粒pTG-TR-BG为模板，分别设计引物，对目的基因进行多点定点突变，结果发现有些突变对其耐热性没有影响，有些突变甚至使耐热性更差了，另外还有些突变，虽然能提高耐热性，但突变后其pH适用范围变窄，均不符合要求。最终，申请人获得了既能显著提高耐热性，又能扩大酸性条件下的适用范围的突变位点的组合：L93I，Y133F，N222G，<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的β‑葡萄糖苷酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β‑葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由Leu变为Ile，第133位氨基酸由Tyr变为Phe，第222位氨基酸由Asn变为Gly，第579位氨基酸由Ile变为Leu，第676位氨基酸由Gln变为Phe。

【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的β-葡萄糖苷酶是氨基酸序列
为SEQ ID NO：1的β-葡萄糖苷酶的第93位氨基酸由Leu变为Ile，第133位氨
基酸由Tyr变为Phe，第222位氨基酸由Asn变为Gly，第579位氨基酸由Ile
变为Leu，第676位氨基酸由Gln变为Phe。
2.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的β-葡萄糖苷
酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷
酶。
4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青，李宾，曹体爽，董计巧，唐波，黄亦钧，王华明，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37