一种高活力酸性蛋白酶制造技术

本发明专利技术公开了一种高活力酸性蛋白酶，属于酶制剂制备技术领域。以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCC NO：M2013601为出发菌株，根据其最适生长温度和最适产酶温度，进行培养基优化和发酵工艺改进，细化了孢子增殖和发酵产酶阶段的工艺参数，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种，致使菌种的产酶能力最大限度地显现，尤其是添加了具有抗热应激原作用、调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、微生态调节功能的中草药提取物，进而增强了微生物的代谢功能，使得本发明专利技术酸性蛋白酶活力高、耐受温度较高、稳定性强、适于工业化生产，发酵液酸性蛋白酶酶活力为13000-14000U/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于酶制剂制备
，具体是一种高活力酸性蛋白酶。
技术介绍
酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类:一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突变株(A.niger var.microsporus)、根霉(Rhizopus sp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘红酵母(Rhdotorula glutinis)、粟疫霉(Endothia parasitica)、血红色陀螺孔菌(Trametessanguinca)、芽枝霉(Cladosporium sp.)等。1903年,德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3.350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3.350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等(1994年)用60Co γ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等(1995年)以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50°C，90°C下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等(1999年)，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等(2006年)对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等(2007)采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云(2008年)通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流(沸腾)干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。中国专利CN 102676395 A公开了一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用，所述宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp.)M1223采用液体深层发酵，发酵液粗酶以酪蛋白为作用底物，该酶最适作用温度为40°C，最适作用pH为3.0，最适作用条件下，酶活性达到5600U/ml。该酶分子量在45KD左右。中国专利CN 101948820 A公开了一种酸性蛋白酶及其制备方法，以黑曲霉(Aspergillus niger)保藏于CICC编号2238为产酶菌种，采用固体发酵工艺制备，发酵产酶能力> 47000u/g(以干曲计)，液体酶收率> 85%,固体酶收率彡80%，最适ρΗ2.5-3.5，稳定ρΗ2.5-6.0 ;最适作用温度为40_50°C，温度稳定性范围为30°C?50°C。综上所述，无论酸性蛋白酶的制备方法如何，酸性蛋白酶酶活及其作用条件仍是本行业技术人员最为关注的问题之一，生产高活力酸性蛋白酶对推动酸性蛋白酶的工业化生产具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)CCTCC NO:M 2013601为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层发酵，制得一种酶活力高、耐受温度较强、耐pH值较宽泛的酸性蛋白酶。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案:所述高活力酸性蛋白酶以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCC NO:M2013601为出发菌株，根据其最适生长温度和最适产酶温度，进行培养基优化和发酵工艺改进，细化制定了孢子增殖和发酵产酶阶段的工艺参数，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种，尤其是梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了出发菌株的抗应激能力。并且对培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强了微生物的代谢功能。所述高活力酸性蛋白酶的酶学性质如下:(1)温度:该酶适应反应温度30-55°C，最适反应温度40-50°C，在40-70°C之间具有较高的酶活；(2) pH:适应 pH 值范围 2-6，最适 pH 值 2.5-3.5 ;(3)酶活性:发酵液酸性蛋白酶酶活可达13000-14000U/mL，是出发菌株的7倍。(4)热稳定性:该酶在70°C条件下保存lh后仍能保持75%以上酶活，65°C条件下保存lh后保持80%以上酶活；(5)存储稳定性:该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于2.2%。所述高活力酸性蛋白酶制备方法包括如下步骤:保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO:M2013601的菌种经斜面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活力酸性蛋白酶，其特征在于，其酶学性质如下：(1)温度：该酶适应反应温度30‑55℃，最适反应温度40‑50℃；(2)pH：适应pH值范围2‑6，最适pH值2.5‑3.5；(3)酶活性：发酵液酸性蛋白酶酶活可达13000‑14000U/mL；(4)热稳定性：该酶在70℃条件下保存1h后仍能保持75％以上酶活，65℃条件下保存1h后保持80％以上酶活；(5)存储稳定性：该酶在室温下保存12个月后酶活损失小于2.2％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪兵，李海清，张锦杰，朱永明，胡永明，刘文明，
申请(专利权)人：湖南新鸿鹰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43