受调节的PEPC表达制造技术

本发明专利技术涉及重组真菌宿主细胞，该宿主细胞包含编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸；和编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸，其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子，连同用于产生感兴趣的多肽的方法，该方法包括培养所述真菌宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】受调节的PEPC表达 对序列表的引用 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 专利
本专利技术涉及重组真菌宿主细胞，该宿主细胞包含编码感兴趣的多肽的至少一种第 一多核苷酸;和编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸，其中该一种或多种第二 多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子，连同用于产生感兴趣的多肽的方法，该方 法包括培养所述真菌宿主细胞。 专利技术背景 在工业多肽制造领域中，对发现用来改进产率和/或储存稳定性的新方式具有持 续的兴趣。已经显示，在真菌和细菌两种重组宿主细胞中，通常通过缺失一个或多个编码基 因而灭活一种或多种蛋白水解酶可导致改进的产率和/或储存稳定性。 然而，还存在这样的实例，其中对于宿主细胞表型而言，灭活宿主细胞中的蛋白水 解酶具有不令人希望的结果。一个这样的实例是灭活烟曲霉宿主中的PepC蛋白酶，其中显 示PepC灭活显著降低孢子形成和生长速率，如由赖卡德(ReicharcOU.等人(2000,国际医学 微生物学杂志（Int J Med Microbiol ·)290,549-558)所报道的。 在生物技术产业中，真菌重组生产宿主细胞保留其形成孢子的能力，以便能够制 备细胞库制剂是非常重要的，这对于一致的多肽制造而言是决定性要求。 专利技术概述 本申请的诸位专利技术人已经证明，灭活米曲霉或黑曲霉中的PepC蛋白酶导致至少3 种不同的多肽，即脂肪酶、角质酶和天冬酰胺酶的产率和/或稳定性大大改进。不幸的是，灭 活PepC蛋白酶也严重妨碍了细胞的孢子形成能力(参见以下实例），在赖卡德(Reichard)U. 等人(见上)看来，这不是完全出乎意料的。 尽管存在这一负面结果，诸位专利技术人还是继续向前，并且他们成功地将编码PepC 的多核苷酸可操作地连接至若干种不同的调节型启动子之一，在适于工业制造多肽的典型 培养条件期间，这些启动子是被抑制的或非诱导的，但是可以通过存在导致PepC表达并且 因此导致正常孢子形成表型的具体化合物来诱导这些启动子或使它们去抑制。换言之，诸位专利技术人已经成功地构建了用于工业制造多肽的高度令人希望的真菌 宿主细胞，取决于条件，该细胞具有拨动开关控制的高产率(PepC灭活)对孢子形成(PepC表 达）。如以下实例中所示，与野生型相比，这些真菌宿主细胞示出高达五倍的更高生产产率， 同时与△ PepC菌株相比，在斜面试管中，它们产生的孢子数要高约一个数量级。 因此，在第一方面中，本专利技术涉及重组真菌宿主细胞，该宿主细胞包含： a)编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸;和 b)编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸，其中该一种或多种第二多核 苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子。 在第二方面中，本专利技术涉及产生感兴趣的多肽的方法，所述方法包括以下步骤： a)在适于产生该感兴趣的多肽的条件下，培养如以上权利要求的任一项中限定的 宿主细胞;并且，可任选地 b)回收该感兴趣的多肽。 附图简要说明图1示出了菌株MLxn69和MLXN70的脂肪酶发酵液样品的考马斯蓝染色的SDS-PAGE 凝胶的照片。泳道1是"完美蛋白标记(Perfect Protein Marker)?"，大小为10_225kDa(诺 瓦根公司（Novagen))。泳道2-5是在第2-5天取的MLxN69样品。泳道6-9是在第2-5天取的 MLxN70样品。粗箭头指示全长脂肪酶蛋白；小箭头指示脂肪酶的降解产物。图2示出了菌株MLXN69和MLXN70的在两个不同温度下孵育的脂肪酶发酵液样品的 考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片。泳道1是"完美蛋白标记?"，大小为10-225kDa(诺瓦 根公司）。泳道2和3是菌株MLxn69和MLxN70的在-18°C下孵育的样品。泳道4和5是菌株 MLxn69和MLxN70的在34°C下孵育的样品。图3示出了在96、144和190hr，来自实例5和6的发酵液样品的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片，示出了表达于由sorA-或sorB启动子调节pepC的菌株中的天冬酰胺酶。泳 道1:分子标记（伯乐（Biorad)#161-0318);泳道2-4:菌株50-C2948-9( APepC);泳道5-7:菌 株50-4C-9(天然PepC);泳道8-10:菌株91-50-C2948-18(PsorA-pepC);泳道 11-13:菌株92-50-C2948-13(PsorB-p 印 C);泳道 14:分子标记。图4示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片，其中在第5天来自两个转化体的 产物形成被可视化。图4中最左侧泳道是"SeeBlue Plus2?"（英杰公司（Invitrogen))，大小 为4-250kDa。泳道2和3分别示出了菌株DAu712(从天然PepC启动子表达的pepC)和Dau729 (从PniaD启动子表达的pepC)在第5天的产物形成。图中的粗箭头指示全长特异腐质霉角质 酶蛋白。小箭头指示脂肪酶的降解产物。通过质谱分析确认蛋白带是全长特异腐质霉角质 酶蛋白（大箭头)抑或其蛋白片段。该图显示在DAu729中PepC-表达的基于氨的抑制(经由其 从调节型PniaD启动子的表达)显著降低了角质酶的降解，因为在泳道3中不可见角质酶降 解产物。图5示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片，其中分析来自实例7中黑曲霉菌 株的发酵样品，以看到天冬酰胺酶产物的降解并且比较其程度。正如所料，来自菌株50-4C-9(天然PepC表达）的样品在PepC存在下严重降解（图5，泳道5-7)，而在菌株50-C2948-9( Δ PepC)中表达的天冬酰胺酶要稳定地多得多（图5,泳道8-10)。来自菌株107-C2948-20 (niaD-启动子PepC表达)的样品中的降解也示出天冬酰胺酶的显著更少的降解（图5,泳道 2-4)，表明在罐发酵条件下，通过niaD启动子进行的PepC表达被强烈抑制。 定义 cDNA:术语"cDNA"意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早 先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接。编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序 列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始 并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其 组合。 控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同 基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少， 控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码 多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组真菌宿主细胞，包括：a)编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸；和b)编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸，其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：寺本宽，宇田川裕晃，J·莱姆贝克，M·L·尼尔森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK