一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种去除农田土壤中PAEs的降解菌固定化微球及其制备方法：(1)菌悬液的制备：将恶臭假单胞菌RXX‑01(保藏编号为CGMCC No.13224)培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD

【技术实现步骤摘要】
一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用
本专利技术属农业生物领域，特别涉及一种去除农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解菌固定化微球及其制备方法和应用。
技术介绍
邻苯二甲酸酯(PhthalicAcidEsters，PAEs)是一类典型的内分泌干扰物，邻苯二甲酸二甲酯(DimethylPhthalate，DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DibutylPhthalate，DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexylPhthalate，DEHP)等6种邻苯二甲酸酯化合物被美国环保局和我国环境监测总站列为优先控制污染物。作为重要的化工产品，邻苯二甲酸酯在塑料制品生产过程被作为添加剂大量使用。我国设施农业的快速发展使塑料制品被广泛应用，随着塑料的老化邻苯二甲酸酯会缓慢释放并最终进入土壤，导致其成为农田土壤中最常被检出的有机污染物之一，尤其在北方设施菜地、南方菜园土壤中邻苯二甲酸酯含量甚至已经达到几十mg·kg-1。其中，DBP和DEHP是土壤中检出率最高且含量较高的2种邻苯二甲酸酯类化合物，由于DBP的分子摩尔质量(278.4g·mol-1)和logKow(4.45，Kow为辛醇-水分配系数)均小于DEHP(分别为390.6g·mol-1、7.50)，而水溶解度(11.2mg·L-1)高于DEHP(0.003mg·L-1)，导致土壤中DBP的微生物利用率相对较高，降解速率高于DEHP，因此，去除土壤中残留的DEHP难度要大于DBP。大量研究表明，土壤邻苯二甲酸酯污染不仅会影响农作物的生长发育和产量品质，而且会造成农产品中邻苯二甲酸酯的累积从而通过食物链对人体健康造成潜在的危害，因此，修复农田土壤邻苯二甲酸酯污染对保护我国农田土壤质量，保障农产品安全、生态安全和人体健康具有十分重要的现实意义。目前，农田土壤邻苯二甲酸酯污染修复技术研究仍处于起步阶段。现有的土壤有机污染修复主要采用物理修复、化学修复和生物修复的方法。其中，生物修复尤其是微生物修复技术由于具有安全、高效、无二次污染、经济效益好等优点，被人们认为是进行有机污染土壤修复最有效、最有前途的一种污染治理技术。国内外学者对邻苯二甲酸酯降解菌进行了筛选，具有一定的降解效果。在实际应用中，由于降解过程中污染物的成分更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大，游离菌表现出单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差等特点。采用微生物固定化技术对降解菌进行固定，可以避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，提高单位体积介质中微生物细胞密度。另外，降解菌固定化微球的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂的土壤环境中也可以稳定地发挥高效能。因此，通过吸附包埋等固定化方法将土壤中筛选出的邻苯二甲酸酯高效降解菌进行固定化后形成微球施用于污染土壤将会极大的提高农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解率，更好地发挥外源降解菌的作用。专利201510418972.7公开了一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用，专利以海藻酸钠、膨润土、壳聚糖和氯化钙为固定化材料制备微球，修复效果为28天土壤中DBP降解率约80％。然而其仅是针对土壤DBP污染问题而且对土壤中DBP的降解效率较低，无法高效应用于DBP和DEHP复合污染土壤中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种去除农田土壤中邻苯二甲酸酯的降解菌固定化微球及其制备方法，能够应对复合污染土壤，不仅能够高效去除DBP，还能有效去除更难降解的DEHP。一种PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其具体步骤如下：(1)菌悬液的制备：将PAEs降解菌培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.8-1.2；所述PAEs降解菌为恶臭假单胞菌RXX-01，分类名为Pseudomonasputida，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCCNo.13224；所述生理盐水为已灭菌的0.9％NaCl溶液；(2)混合菌液的配备：用无菌水配制海藻酸钠溶液，将活性炭加入到海藻酸钠溶液中混匀得混合液，向混合液中加入步骤(1)的菌悬液混匀得混合菌液；各组份所占重量比分别为：菌悬液15-25％，海藻酸钠2-3％，活性炭2-4％；(3)固定化微球的制备：用无菌水配制20-30g/L的氯化钙溶液，并将混合菌液逐滴滴入氯化钙溶液中，交联20-30h后制备得到固定化微球；混合菌液与氯化钙溶液的体积比为1:1.5～1:2。海藻酸钠在水溶液中电解产生海藻酸阴离子，氯化钙产生二价钙离子，钙离子与海藻酸阴离子发生静电作用而吸引，交联形成不溶于水的海藻酸钙。进一步地，混合菌液各组份所占重量比分别为：菌悬液20％，海藻酸钠3％，活性炭2％；用于制备固定化微球的氯化钙溶液的浓度为25g/L。进一步地，所述海藻酸钠、活性炭、氯化钙均在使用前灭菌。进一步地，所述步骤(1)中恶臭假单胞菌RXX-01的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，组份为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000mL。进一步地，所述步骤(1)中恶臭假单胞菌RXX-01的培养条件为：25-30℃、pH6.5-7.5、150-200r/min恒温震荡培养24-72h。优选28℃、pH7.0、170r/min恒温震荡培养24h。进一步地，所述步骤(1)中清洗菌体的方法为：将恶臭假单胞菌RXX-01的培养液于3500-4500rpm离心5-15min，弃上清液，用灭菌的生理盐水重悬沉淀后，重复离心及重悬沉淀的步骤1-3次。进一步地，所述步骤(3)中采用蠕动泵将混合菌液滴入氯化钙溶液中，流量控制在6mL/min。进一步地，所述步骤(3)制备好的固定化微球用无菌蒸馏水冲洗干净，4℃保存。本专利技术还提供了以上述方法制备得到的PAEs降解菌的固定化微球。此外，本专利技术还提供了所述PAEs降解菌的固定化微球在降解农田土壤邻苯二甲酸酯中的应用。进一步地，所述PAEs降解菌的固定化微球在降解农田土壤中邻苯二甲酸酯时的用量为0.1-1kg/kg干土。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术采用活性炭、海藻酸钠和氯化钙为原材料制备固定化微球，即以活性炭为载体材料，通过海藻酸钠进行包埋固定邻苯二甲酸酯高效降解菌制备得到微球，制备方法操作简单。(2)降解菌的固定化效果好，对土壤中邻苯二甲酸酯的降解效率高，适宜于大面积的农田土壤邻苯二甲酸酯污染原位修复。固定化微球培养10天后对土壤中DBP和DEHP的降解率分别达到94.0％和34.5％；相比之下，空白对照组DBP和DEHP的降解率分别为27.9％和5.8％，游离菌处理组介于两组之间，DBP和DEHP的降解率分别达到91.2％和25.4％。附图说明图1恶臭假单胞菌RXX-01的划线培养结果；图2不同条件下制备的24种固定化微球对土壤中DBP和DEHP的降解率；图3实施例4制备的固定化微球的形态图；图4实施例4制备的固定化微球对土壤中DBP的降解率；图5实施例4制备的固定化微球对土壤中DEHP的降解率。生物材料样品保藏信息：恶臭假单胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)菌悬液的制备：将PAEs降解菌培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD

【技术特征摘要】
1.一种PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)菌悬液的制备：将PAEs降解菌培养至对数生长期，用生理盐水将菌体洗净后，再用生理盐水将菌体调配成菌悬液，使菌悬液的OD600＝0.8-1.2；所述PAEs降解菌为恶臭假单胞菌RXX-01，分类名为Pseudomonasputida，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年11月1日，保藏编号为CGMCCNo.13224；所述生理盐水为灭菌的0.9％NaCl溶液；(2)混合菌液的配备：用无菌水配制海藻酸钠溶液，将活性炭加入到海藻酸钠溶液中混匀得混合液，向混合液中加入步骤(1)的菌悬液混匀得混合菌液；各组份所占重量比分别为：菌悬液15-25％，海藻酸钠2-3％，活性炭2-4％；(3)固定化微球的制备：用无菌水配制20-30g/L的氯化钙溶液，并将混合菌液逐滴滴入氯化钙溶液中，交联20-30h后制备得到固定化微球；混合菌液与氯化钙溶液的体积比为1:1.5～1:2。2.根据权利要求1所述的PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其特征在于，混合菌液各组份所占重量比分别为：菌悬液20％，海藻酸钠3％，活性炭2％；用于制备固定化微球的氯化钙溶液的浓度为25g/L。3.根据权利要求1所述的PAEs降解菌的固定化微球的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：周震峰，饶潇潇，王亚娟，
申请(专利权)人：青岛农业大学，宁夏大学，
类型：发明
国别省市：山东,37