表达嗜热子囊菌光孢变种lgh基因的毕赤酵母工程菌株制造技术

本发明专利技术是一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus)热稳定脂肪酶基因1gh的毕赤酵母工程菌GS-TA-LGH。通过RT-PCR及RACE等方法从嗜热子囊菌光孢变种中获得脂肪酶基因1gh，构建表达载体pPIC9K/1gh，并导入毕赤酵母GS115，从中筛选出一种表达脂肪酶的酵母工程菌GS-TA-LGH。该工程菌脂肪酶的酶活性可达19.92U/mg，酶在50℃保温60min，不损失活性，在60℃保温60min，仍有66％的活性。具有较高的热稳定性，作为热稳定脂肪酶的生产菌株，具有经济价值和社会价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascu aurantiacus var. Ievisporus热稳定脂肪酶基因Igh的毕赤酵母工程菌株 Pichiapastoris GS-TA-LGH。
技术介绍
脂肪酶(lipase)全称三酰甘油酰基水解酶，属于α/β折叠酶家族。它能够分解生物产生的各种天然油和脂肪，在生物体内参与胞内脂的代谢等重要生命活动。脂肪酶的应用涉及洗涤剂、食品、油脂、皮革、医药等工业，近些年来又被研究用于制备化学方法难以得到的手性化合物，以及用于生产作为绿色可再生能源的生物柴油，使得它再度成为生物及化工工业的研究热点。因为微生物脂肪酶种类多、周期短，耐受性好且易于工业生产，所以在酶理论研究和工业应用中有着更重要的作用。嗜热子囊菌光抱变种(Thermoascusaurantiacus var. blevisporus)在以撤揽油为诱导源的培养基中50°C条件下可以产生热稳定的脂肪酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热子囊菌光孢变种培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热子囊菌光孢变种热稳定脂肪酶基因导入常温酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定脂肪酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。
技术实现思路
本专利技术以嗜热子囊菌光抱变种(Thermoascusaurantiacus var. levisporus)为材料获得一种脂肪酶基因，命名为lgh，全长cDNA为1009bp，包含一个由894个核苷酸构成的开放阅读框，编码297个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现该脂肪酶属于脂肪酶第3家族。构建重组表达质粒载体pPIC9K/lgh,利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GSl 15，在MD和丽培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28°C 200rpm/min摇床培养6d后，脂肪酶活达到19. 92U/mg, SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为58kDa，酶在50°C保温60min，不损失活性，在60°C保温60min，仍有66%的活性。具有较高的热稳定性，有重要的经济价值和社会价值。附图说明图I脂肪酶基因IghPCR产物电泳图谱泳道M Marker-DL2000泳道2 :cDNA(0RF)图2脂肪酶LGH的SDS-PAGE分析泳道M:低分子量蛋白Marker泳道1-7 :酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-LGH的诱导1-7天的表达情况图3重组脂肪酶LGH的纯化泳道M :低分子量蛋白标准泳道I :纯化的重组脂肪酶LGH具体实施方式实施例I :嗜热子囊菌光孢变种(T. aurantiacus var. levisporus)的分离鉴定(I)标本采集从堆肥中采集。(2)分离培养将采集标本取O. 5克放置在PDA平板上50°C培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson (1964)文献。(3)鉴定参考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文献。实施例2 :脂肪酶基因Igh的克隆(I)嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取参照Trizol试剂盒说明。(2)cDNA 第一条链的合成按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O 试剂盒说明书进行取广2 μ g总RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 μ L，将RNA样品在75°C 变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分10mmol/L dNTP Mixture2 μ L，10 X RTBuffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligo d(T)-Adaptor Primerl μ L, RNaseInhibiterO.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L (Final Volume20 μ L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸 5min以灭活反转录酶。加入180 μ L DEPC处理的ddH20，稀释至200 μ L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。(3)中间片段的分离根据脂肪酶的同源保守序列设计兼并引物。上游引物为 5’ -CTCTGCYGCMKCBTATTG-3’，下游引物为5’ -CRCTGGTRAYCCAGTACTC-3’(4)3’和5’序列的分离脂肪酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，根据中间前面得到片段设计3个向外的特异巢式引物，以及通过巢式引物以及上游公共兼并引物ADh扩增得到。Iip-TAIL-I :5，-GGGGACAGCCGTAGGGGTAGAGAT-3，lip-TAIL-2 :5，-GAGGTCATCCGACACCGAGTTCCAC-3Iip--TAIL-3 :5，-TCGTCTTGGTATCCGCCGCCTC-3’AD15， -NTCGASTWTSGWGTT-3，AD25， -NGTCGASWGANAWGAA-3，AD35’ -WGTGNAGffANCANAGA-3 AD45’ -TGWGNAGSANCASAGA-3’AD55，-AGffGNAGffANCAffAGG-3 脂肪酶基因 3’ 端序列克隆，按照 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O (TaKaRa)和 3’ RACE Kit, 2nd Genneration(Roche Applied Science)使用说明进行。3’ RACE 的上游引物序列为5’ -AATCGTGGAACTCGGTGT-3’5， -ACTGTTGGGACACTGGTTCT-3’下游引物为M13M4:5’ -GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。(5)基因克隆取O. 5 μ IPCR回收产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照 TaKaRa公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂有X — gal 和IPTG的含氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。(6)质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。(7)序列测定DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行，序列引物为M13启动子引物。嗜热子囊菌光孢变种Igh全长的cDNA为1009bp。开放阅读框部分为894bp，编码297个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索， 发现属于脂肪酶第3家族。该序列如下(A) SEQ ID NOl 的信息(a)序列特征*长度1009碱基对；*类型核酸；*链型双链；*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(C)假设否(d)反义否Ce)最初来源嗜热子囊菌光孢变种(Th本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus?aurantiacus?var.levisporus)脂肪酶基因lgh的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT?PCR及RACE等方法从嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascusaurantiacus?var.levisporus）获得热稳定脂肪酶基因lgh，将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/lgh，转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定脂肪酶基因lgh的毕赤酵母工程菌株GS?TA?LGH。

【技术特征摘要】
1.一种表达嗜热子囊菌光抱变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)脂肪酶基因Igh的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR及RACE等方法从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascusauran...

【专利技术属性】
技术研发人员：李多川，李萌，郭晓红，黄刚，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：