呈现增强的木质纤维素水解产物发酵的改良酵母菌株制造技术

公开了一种与亲代菌株相比具有增强的发酵木糖的能力的改良酵母属菌株Y108-1(ATCC保藏号No.PTA-10567)，以及一种使用所述改良菌株共发酵木质纤维素水解产物中的木糖和葡萄糖以产生发酵产物，例如醇或糖醇的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有增强的利用木质纤维素水解产物生长和/或发酵能力的新酵母菌株。
技术介绍
植物细胞壁主要由大生物聚合物纤维素、半纤维素、木质素和果胶构成。纤维素和半纤维素构成了一种用于生产可发酵糖的可再生且廉价的重要碳源。纤维素由通过β-1，4糖苷键以直链连接在一起的D-葡萄糖单元构成。半纤维素主要由直链木糖骨架和多个侧链(例如，L-阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸等)构成，所述直链木糖骨架包含通过β -I, 4糖苷键连接在一起的D-木糖单元,所述侧链通过糖苷键或酯键与所述木糖单元连接。术语木质纤维素通常用于描述包含纤维素、半纤维素和木质素的植物来源的生物质。近年，已经非常关注并致力于从含木质纤维素的原料例如农业废料和林业废料生产燃料和化学品，主要为乙醇，原因是农业废料和林业废料成本低并广泛可得。这些农业废料和林业废料通常被燃烧或掩埋；因此，使用这些木质纤维素原料用于乙醇生产提供了代替丢弃的有吸引力的方案。这些原料的另一个优势是木质素副产物——其在所述纤维素转化过程后仍然存在——可用作燃料来代替化石燃料为所述过程提供动力。若干研究已得出结论当考虑整个生产和消耗循环时，使用由纤维素生产的乙醇产生接近于零的温室气体。相比之下，来自诸如玉米淀粉、甘蔗和甜菜的原料的燃料乙醇受到这些原料已经用作人和动物食物来源的限制。使用这些原料的另一缺点是在其转化过程中使用化石燃料。因此，这些过程对减少温室气体仅有有限的作用。木质纤维素生物质也已被考虑用于生产除乙醇以外的其它发酵产物。所述产品的实例包括乳酸、山梨醇、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、丙二醇、丁二醇、木糖醇、丙酮和丁醇。将木质纤维素原料转化为乙醇或其它发酵产物的第一个化学处理步骤涉及将所述纤维素和半纤维素聚合物水解为糖单体，例如葡萄糖和木糖，其可在后续发酵步骤中被转化为乙醇或其它发酵产物。所述纤维素和半纤维素的水解可用一步化学处理或用温和化学预处理后以纤维素酶酶水解所述预处理木质纤维素的两步法实现。在一步化学处理中，使所述木质纤维素原料与强酸或碱在足以将所述原料的纤维素和半纤维素组分水解为糖单体的条件下接触。在两步化学-酶水解方法中，首先将所述木质纤维素原料在与浓酸或浓碱水解方法的条件类似但较温和的条件下进行预处理。所述预处理的目的是增加纤维素表面积并将纤维状原料转化为泥状结构，而纤维素到葡萄糖的转化有限。如果用酸进行所述预处理，那么就将所述原料的半纤维素组分水解为木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖。所得到的水解产物——其富于衍生自半纤维素的戊糖——可与固体物分离并用于后续发酵过程以将所述戊糖转化为乙醇或其它产物。如果用碱进行所述预处理，那么所述多糖发生非常少的水解；然而，碱处理会通过与所述半纤维素上存在的酸基团反应而打开所述纤维素的表面。在所述预处理步骤后，将所述纤维素用一种或多种纤维素酶例如外纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β -葡萄糖苷酶(β -G)进行酶水解。CBH和EG酶可催化纤维素中β-1，4- -葡聚糖键的水解。CBH酶例如CBHI和CBHII可作用于纤维素微纤丝中的葡萄糖聚合物的末端并释放纤维二塘，而EG酶可作用在所述纤维素聚合物内的随机位置。综上，所述纤维素酶将纤维素水解为纤维二糖，其转而被β-G水解为葡萄糖。除CBH、EG和β -G酶以外，在所述水解反应过程在还可存在增强预处理的木质纤维素底物的酶降解的其它酶或蛋白，例如木糖酶、木糖苷酶、β -甘露聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、膨胀因子(swollenin)和膨大素(expansin)。木糖酶的存在可能是有利的,例如,在经预处理的原料中存在大量木糖的情况下。如果在预处理和酶水解步骤之间将所述戊糖与固体物分离，那么葡萄糖将是通过酶处理产生的水解产物中主要的糖单体。如果使由所述化学预处理步骤释放的戊糖带至酶水解步骤，那么水解产物将含有约2:1的重量比的葡萄糖和木糖，其中L-阿拉伯糖为总糖单体的约3-5wt%。将产生的木质纤维素的水解产物(有时称为木质纤维素水解产物)中的己糖和戊糖转化为乙醇或其它产物在后续微生物发酵中进行。如果葡萄糖是所述水解产物中存在的优势糖，那么所述发酵通常用酵母属(Saccharomyces spp.)酵母进行,其将此糖和存在的其它己糖转化为乙醇。然而,如果所述水解产物包含高比例的戊糖例如衍生自半纤维素的木糖和阿拉伯糖，那么所述发酵用天然具有或通过遗传工程具有将木糖和/或阿拉伯糖发酵为乙醇或其它产物的能力的微生物进行。可天然依靠戊糖例如木糖或阿拉伯糖生长并且/或者将其发酵成乙醇或糖醇类的微生物实例包括但不限于属于假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的某些种的酵母。然而，所述酵母通常以较酵母属低得多的速率发酵葡萄糖。这在用于发酵含有高比例葡萄糖和木糖的木质纤维素水解产物的方法中是特别大的限制。已进行遗传修饰以利用木糖生长或发酵的微生物实例包括但不限于已插入(a)来自树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶(XR)编码基因和木糖还原酶(XDH)编码基因(分别为 XYLl 和 XYL2)(美国专利 No. 5，789，210、5，866，382、6，582，944和7，527，927以及欧洲专利No. 450530)，或者(b)真菌或细菌木糖异构酶(XI)基因(美国专利No. 6，475，768和7，622，284)的重组酵母属菌株。这些菌株既能够利用木糖又能够利用葡萄糖进行生长和/或发酵。被遗传修饰以利用L-阿拉伯糖进行生长和/或发酵的酵母实例包括但不限于已插入来自真菌(美国专利No. 7，527，951)或细菌(国际专利公开No. WO 2008/041840)阿拉伯糖代谢途径的基因的重组酵母属菌株。在某些实例中，已开发了既可利用木糖又可利用阿拉伯糖进行生长和/或发酵的重组酵母属菌株(国际专利公开No. W02006/096130)。已通过遗传工程和/或适应进化技术对这些菌株进行了进一步遗传修饰，以增强木糖转化率或木糖的乙醇产率。这些修饰包括过表达糖转运子(美国专利公开No. 2007/0082386)、缺失内源非特异性醛糖还原酶GRE3 (美国专利No. 6，410, 302)和增强磷酸戊糖途径(国际专利公开No. WO 2005/108552 ;美国专利公开No. 2006/0216804和2007/0082386)ο然而，尽管所述木糖转化速率和/或木糖的乙醇得率随纯糖发酵增加,但对于木质纤维素水解产物中的戊糖发酵未观察到也未见报道类似的结果。木质纤维素水解产物，不管是通过一步化学处理方法还是通过两步化学预处理 及酶水解方法生产，均通常不仅包含糖单体例如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，而且包含木质素单体、乙酸盐(从所述半纤维素侧链释放)和所述糖的化学反应产物例如糠醛(来自木糖)和羟甲基糠醛(来自葡萄糖)。乙酸盐、糠醛和羟甲基糠醛是微生物生长和/或将糖转化为乙醇的发酵过程的公知抑制物。木质纤维素水解产物中存在乙酸特别成问题，因为其会抑制酵母细胞生长并因此显著降低发酵产物的产率(Abbott et al. (2007)FEMS YeastRes. 7:819-33)。将木质纤维素原料转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.30 US 61/291,011;2010.02.24 US 61/307,5361.一种能够利用木质纤维素水解产物中的木糖生长或发酵的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株包含 (a)选自AREl、VBA3、RNQl、FUSl、PDII、BUD23、IMGU DDI2、SN03、SNZ3、YCL042W、YCL073C、YCR045C和tE (UUC)B的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自ALD2、SSA2、MST27、PRM8、ERV14、ECM21、ILSI、PRP6、YBLIOOff-C、YBR201C-A 和tE(UUC)G2的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。2.一种能够利用木质纤维素水解产物中的木糖生长或发酵的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株包含(a)选自GALUGAL 7、GAL10、GAL80、PGM1、HXT1、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRR1、ERG1、ERG8、ERG10、ERG11、ERG20、ERG25、ERG 26、ERG27、HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT 6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。3.权利要求I的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含(a)选自GAL1、GAL7、GALlO、GAL80、PGMl、HXTl、HXT2、HXT3、GAL2、HXK2、GRRl、ERGl、ERG8、ERGlO、ERGlI、ERG20、ERG25、ERG 26,ERG 27,HMGl 和 CYB5 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；(b)选自GAL3、GAL4、GAL11、PGM2、HXT4、HXT5、HXT 6、HXT7、HXT9、HXT11、HXT12、SNF3、RTG2和REGl的一个或多个基因的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。4.权利要求I的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含 (a)选自BIKl、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24 和 ERG28 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加； (b)ALD3的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。5.权利要求2的改良酵母菌株，其相对于衍生出所述改良酵母菌株的亲代酵母菌株还包含 (a)选自BIKl、GLK1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG24 和 ERG28 的一个或多个基因的拷贝数或表达增加；或 (b)ALD3的拷贝数或表达减少；或 (c)同时(a)和(b)。6.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的葡萄糖发酵为乙醇。7.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的葡萄糖发酵为乙醇。8.权利要求I的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的阿拉伯糖发酵为乙醇。9.权利要求2的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株还能够将木质纤维素水解产物中的阿拉伯糖发酵为乙醇。10.权利要求I的改良酵母，其中所述菌株是酵母属。11.权利要求2的改良酵母，其中所述菌株是酵母属。12.权利要求10的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因。13.权利要求11的改良酵母菌株，其中所述亲代酵母菌株包含编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的导入基因。14.权利要求12的改良酵母菌株，其中所述改良酵母菌株相对于所述亲代酵母菌株还包含编码木糖还原...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·唐纳森，JM·A·吉尔特曼，G·D·芒克沃德，G·皮若，P·J·迪弗雷纳，L·古达内特塞维奇，
申请(专利权)人：埃欧金能源公司，
类型：
国别省市：