一种嗜热毛壳菌磷脂酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，包括如下步骤：1）嗜热毛壳菌磷脂酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌磷脂酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；2）嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建；3）里氏木酶的转化与嗜热毛壳菌磷脂酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌磷脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；4）嗜热毛壳菌磷脂酶的分离与提纯。本发明专利技术还公开了上述方法制得的嗜热毛壳菌磷脂酶以及其在制备面食产品中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种磷脂酶，尤其涉及一种嗜热毛壳菌磷脂酶；另外本专利技术还涉及该嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法和应用。
技术介绍
磷脂酶(Phospholipase)是可以水解甘油磷脂的一类酶。磷脂酶可分为磷脂酶A1，A2，B，C，D，不同磷脂酶作用于磷脂的不同位点，从而形成不同的产物，被广泛用于甘油磷脂的改造。磷脂酶普遍存在于动物、植物和微生物中。在工业化生产中，由于微生物来源的磷脂酶具有种类多、繁殖快、具有比动植物更广泛的pH、温度适用性及底物专一性，且微生物来源的磷脂酶一般都是分泌性的胞外酶、单亚基蛋白、容易大量快速制备和成本低等特点，已经成为当前食品工业应用的最重要途径。但是野生菌株的磷脂酶生产能力往往很有限，无法满足工业生产的要求。此外，为了适应工业生产过程中高温、高压、高酸度、高离子浓度以及重金属离子超标的极端环境，就需要对现有的磷脂酶进行改造，以适应生产的需要。通常包括两个方面：磷脂酶高产微生物的选育及磷脂酶蛋白的修饰和分子生物学改造。但磷脂酶反应条件温和，具有优良的立体选择性、环境友好，因此在食品、油脂等工业中均具有广泛的应用。磷脂酶在植物油脱胶以及焙烤食品工业、乳制品加工业、蛋黄酱加工业等领域具有重要用途。在食品工业方面，PLA1（磷酯酶A1)、PLA2（磷酯酶A2）和PLC（磷酯酶C）可被广泛应用于油脂脱胶，同时由于磷脂酶作用于磷脂后产生的极性脂质能在气-液界面，以形成脂质单层的能力提升面团气室的稳定性，也就是说，面粉极性脂类和面筋蛋白之间的相互作用在面团持气性方面起重要的作用，通过改善面筋品质来提升面团耐受性、醒发稳定性及入炉急涨、成品体积等方面的表现，因此在烘焙行业应用也非常广泛。在饲料改良方面，磷脂酶被添加于饲料中水解甘油磷脂，可改善饲料的利用效率和促进动物生长。1、磷脂酶在油脂工业中的应用磷脂为两性分子，一端为尾端含磷的亲水基，一端为长烃基链的疏水基，因此磷脂是一种具有亲水亲油性能的乳化剂。植物毛油中含有磷脂、蛋白质和糖类等成分，这些成分同油脂组成溶胶体系，称之为“胶溶性杂质”。由于其存在状态容易受到温度、水分和电解质的影响而发生改变，胶溶性杂质的存在会降低油脂的使用价值、贮藏稳定性以及对油脂的精炼和加工过程中产生一系列不良影响，从而导致成品油质量下降。因此油脂精炼工艺中一般是先脱胶，即脱除植物毛油中溶胶性杂质的工艺过程。植物油中的磷脂分为两种,一种是水化磷脂,可以通过水化脱胶、超级脱胶、联合脱胶等传统的脱胶方法除去；另一种是非水化磷脂,这些磷脂通过化学脱胶方法则很难脱除,致使油中的磷脂残留量仍然很高,给油脂精炼带来了很多的麻烦。脱胶不完全会导致精炼损失大,加重后段脱色、脱酸、脱臭的负担,对设备影响也比较大,造成过滤困难、设备结焦和增加白土的消耗等。同时,成品油中高含磷量往往伴随着较多的金属离子,造成成品油易酸败和回色现象。植物油脱胶是利用胶溶性杂质的亲水性和在介质作用下使不水化的胶质转化成可水化胶质的原理，使胶溶性杂质吸水膨胀，凝聚并分离出来。因此，良好的脱胶效果是油脂精炼的前提，一般要求含磷量降到10mg/kg以下。传统脱胶主要采取的是物理法和化学法，需要使用大量的水以及酸、碱等化学物质。酶法脱胶是油脂精炼过程中的一种生化脱胶技术,该法利用磷脂酶水解磷脂的脂肪酸链而生成水化性溶血磷脂,再通过水化的方法除去。同传统的脱胶方法相比,酶法脱胶具有高效，经济环保等优点，可使得脱胶过程中化学品的使用量大大降低，并且能够提高油品得率，反应条件温和,可大大节约化学物质的消耗量,几乎不产生废水,在环保、经济、质量等方面具有潜在的优势。2、磷脂酶在面包和馒头加工中的应用面粉中的脂类物质是由不同化学结构及不同组成共同构成的多种脂类的总称。脂类可分为自由脂类与结合脂类。这两种脂类都包含极性与非极性脂类。极性脂类可被分为糖脂和磷脂。小麦粉中有2-3%内源脂类可作为磷脂酶的底物。磷脂酶改善面粉脂质或外源脂类，其中一些水解产物目前对磷脂酶的研究，主要基于在面团操作过程、醒发过程及烘烤过程中对面团的影响来做判断。在烘焙应用中添加磷脂酶A1，则卵磷脂1位释放一个脂肪酸产生-1-酰基甘油磷酸胆碱，也就是溶血卵磷脂，这是一个乳化性能更好的产品，在烘焙中有非常积极的影响，相比于未修饰的脂质提升了气-液界面表面活性，因此改善了面团的气室稳定性，同时改善了组织结构、提升面团的稳定性及体积。申请人于2013年申请了专利号为“201310280267.6”，专利技术名称为“一种嗜热毛壳菌纤维素酶及其制备方法和应用”的专利技术专利，本专利技术的目的基因序列（即嗜热毛壳菌磷脂酶基因的序列如SEQIDNO.1所示）与上述ZL201310280267.6专利中的嗜热毛壳菌纤维素酶没有同源性，与脂肪酶和磷脂酶都有一定的同源性，但同源水平不高，从系列很难判断为磷脂酶，分别以甘油三酯水解酶和磷脂酶的测定方法及气象色谱分析水解产物后，进一步判断为该酶为磷脂酶A1。因此，ZL201310280267.6专利不存在采用里氏木霉表达嗜热毛壳菌磷脂酶的技术启示。目前尚未有采用里氏木霉来表达嗜热毛壳菌磷脂酶的相关报道。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题之一是提供一种嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法。本专利技术解决的技术问题之二是提供采用上述方法制得的嗜热毛壳菌磷脂酶。本专利技术解决的技术问题之三是提供该嗜热毛壳菌磷脂酶的应用。为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的一方面，提供一种嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，该方法包括如下步骤：1）嗜热毛壳菌磷脂酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌磷脂酶基因的序列如SEQIDNO.1所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；2）嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建；3）里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌磷脂酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌磷脂酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；4）嗜热毛壳菌磷脂酶的分离与提纯。作为本专利技术优选的技术方案，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由SacⅡ和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建。作为本专利技术优选的技术方案，步骤3）具体为：首先，用EcoRI降解步骤2）构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在有选择压力的培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种至PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析；所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。作为本专利技术优选的技术方案，步骤4）具体为：发酵罐培养转化子，生产出磷脂酶PleA，收集产PleA酶菌的发酵液，通过离心去除菌丝体，收集上清液；使用自动层析系统控制流速、梯度和收集洗脱组分；上清液先上样至层析柱脱盐和置换缓冲液，用缓冲液洗脱并收集，收集液上样至阴离子交换层析柱，洗脱并收集组分；用酯酶检测方法分析阴离子洗脱各组分中酯酶的活力，同时用SDS-PAGE分析蛋白条带，收集酯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）嗜热毛壳菌磷脂酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌磷脂酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示, 合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；2）嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建；3）里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌磷脂酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌磷脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；4）嗜热毛壳菌磷脂酶的分离与提纯。

【技术特征摘要】
1.一种嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1）嗜热毛壳菌磷脂酶基因的合成，合成的嗜热毛壳菌磷脂酶基因的序列如SEQIDNO.1所示,合成的基因编码更加符合里氏木霉高效表达的基因编码；2）嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建；3）里氏木霉的转化与嗜热毛壳菌磷脂酶高产菌株的筛选，得到的嗜热毛壳菌磷脂酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；4）嗜热毛壳菌磷脂酶的分离与提纯。2.如权利要求1所述的嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：将步骤1）所得的产物由SacⅡ和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成嗜热毛壳菌磷脂酶表达质粒的构建。3.如权利要求1所述的嗜热毛壳菌磷脂酶的制备方法，其特征在于，步骤3）具体为：首先，用EcoRI降解步骤2）构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUTC-30宿主细胞；然后在有选择压力的培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种至PDA培养基上，通过生长和发芽，将孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新良，张民，张珊嘉，黄荣慧，段园园，
申请(专利权)人：湖南尤特尔生化有限公司，上海尤特尔生化有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43