来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸；本发明专利技术提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力2～5倍，可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于进一步合成普瑞巴林。

【技术实现步骤摘要】
来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用(一)
本专利技术涉及脂肪酶编码基因的克隆和利用基因突变技术制备脂肪酶突变体的方法，所获得的突变体及其在普瑞巴林手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用。(二)
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是一类既能催化酯水解，又具有催化酯合成、转酯化、氨解、醇解等反应的酶，在食品、洗涤、饲料、有机合成和生物能源等领域应用广泛(Curr.Opin.Biotech.2002,13:390-397)。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少，产物光学纯度高等特点外，还具有催化反应条件温和、绿色环保等优势。这使得脂肪酶在光学纯化合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势，已成为制备光学纯手性药物的重要技术手段(Coord.Chem.Rev.2008,252:659-701.)。普瑞巴林(Pregabalin)是一种新型γ-氨基丁酸(GABA)受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，具有良好的抗焦虑和神经痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Edit.2008,47:3500-3504)。由于疗效显著和适应症的扩大，普瑞巴林的销售额逐年递增，2013年达到45.95亿美元，列全球最畅销药物榜第13位，市场潜力巨大。2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)被脂肪酶/酯酶选择性水解，其产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。该中间体经脱羧、碱性水解、氢化即得到普瑞巴林(Org.ProcessRes.Dev.2008,12:392-398)。但目前只有来源于Novozymes公司的即商品化Thermomyceslanuginosus脂肪酶能满足工业化生产的需要。因此，开发能够高效拆分CNDE的新催化剂具有重要意义。热稳定酶一般具有较强的溶剂稳定性，具有很好的生物技术和工业应用潜力(Environ.Technol.2010,31:1159-1167)。近年来，从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术和工业界的研究热点。嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)是一类分布广泛，生长温度上限较高的嗜热真菌，已成为具有工业应用价值热稳定酶的重要来源。随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用分子改造的手段对酶分子进行改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，这项技术已被成功用于改造各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展(Curr.Opin.Struct.Biol.2011,21:473-480)。分子改造广泛应用于脂肪酶催化活力、底物特异性、热稳定性和对映体选择性等性质的改造。(三)
技术实现思路
本专利技术目的在于通过定点饱和突变技术对嗜热踝节菌的脂肪酶进行改造，提供脂肪酶突变体，其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明显提高，从而有利于该脂肪酶在普瑞巴林中间体制备中的应用。本专利技术的另一目的还在于提供含有编码本专利技术所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列。本专利技术的再一目的在于将本专利技术的突变体应用于选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术通过对来源于T.thermophilusATCC20186脂肪酶基因进行克隆表达，利用全质粒PCR技术对含有脂肪酶基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库，利用基于真实底物的96孔板高通量筛选方法进行筛选，获得了一系列对CNDE活力明显提高且对映体选择性严格的脂肪酶突变体，这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，在室温和较高的温度下高效生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。最终本专利技术提供一种来源于嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)ATCC20186的脂肪酶突变体，所述来源于嗜热踝节菌(T.thermophilus)ATCC20186的脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示，核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述脂肪酶突变体是将SEQIDNo.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸(氨基酸序列为SEQIDNo.4所示，核苷酸序列为SEQIDNo.3所示)，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQIDNo.6所示，核苷酸序列为SEQIDNo.5所示)，优选所述脂肪酶突变体是将SEQIDNo.2所示氨基酸序列将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸(氨基酸序列为SEQIDNo.6所示，核苷酸序列为SEQIDNo.5所示)。本专利技术还涉及一种所述来源于嗜热踝节菌ATCC20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用，具体所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为螯合剂(用于解除产物抑制剂)，以水或缓冲液(优选Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成pH值为6.0～8.0(优选pH值为7.0)的转化体系，30～60℃、150～500r/min条件下(优选40℃、500r/min)进行转化反应，反应结束后，取反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度为0.1～3.0mol/L转化体系(优选1mol/L)，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为10～50g/L转化体系(优选50g/L)，Ca(OAc)2终浓度为50～180mmol/L转化体系(优选150mmol/L)。本专利技术所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min培养12h，再以体积浓度1％接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1～1.0mM(优选0.1mM)的IPTG，28℃诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，溶剂为去离子水，pH值为7.0；LB平板培养基组成为(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，琼脂15，溶剂为去离子水，pH值为7.0。本专利技术所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心除去菌体，取上清液减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取(除去残留底物)，取萃取层减压蒸馏至干(去除残留甲苯和水)，得到目标产物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。本专利技术所述的脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本专利技术的脂肪酶突变体制成固定化酶或者固定化细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种来源于嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)ATCC20186的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示，其特征在于所述脂肪酶突变体是将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。2.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌ATCC20186的脂肪酶突变体在制备普瑞巴林关键手性中间体中应用，其特征在于所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为螯合剂，以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.0～8.0的转化体系，30～60℃、150～500r/min条件下进行转化反应，反应结束后，取反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为0.1～3.0m...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，郑仁朝，黎小军，吴欣玮，沈寅初，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33