本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一种源自嗜热链球菌的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其序列如SEQ ID NO:1-63中任意一个的第n-20位所示且n＝1-5。本发明专利技术还公开了序列为5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其编码DNA分子，识别序列对应的DNA序列与靶序列相同。本发明专利技术还公开了一种CRISPR-Cas9系统，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体。本发明专利技术还公开了CRISPR-Cas9系统在编辑CXCR4基因和制备用于HIV感染的药物中的应用。本发明专利技术可以实现CXCR4基因的编辑，使得细胞无法被HIV感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及嗜热链球菌CRISPR_Cas9系统识别的靶序列和 sgRNA及它们的相关应用。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)又称艾滋 病，是一种危害性极大的传染病。自发现的三十多年来，AIDS已累计导致两千余万人死亡， 一直是一个巨大的公众健康难题，影响着全球3, 530万人的生活。AIDS是由人类免疫缺陷 病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的，HIV是一种感染人类免疫系统细 胞的慢病毒，属反转录病毒的一种，又称为艾滋病毒。HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型， HIV-1的致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。 ⑶4+T细胞是HIV-1病毒感染过程的首要靶点，随后研究又发现仅有⑶4分子并不 能介导HIV-1病毒的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体（coreceptor)。1996年证实， 趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的辅助受体。其中，趋化因子CCR5,作为G 蛋白親联受体（G-protein coupled receptor，GPCR)超家族的细胞膜蛋白，是HIV-1入侵 机体细胞的主要辅助受体之一。CCR5主要在静止期记忆性T淋巴细胞、单核细胞和未成熟 的树突状细胞的膜上表达，是HIV-1入侵人体时重要的辅助受体，它作为HIV-1入侵机体细 胞的主要辅助受体之一，在治疗艾滋病研究中是一个重要的药物靶点。 其中，趋化因子受体CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(CXCL12)的特异受 体。CXCL12对淋巴细胞有强烈的趋化作用。CXCR4主要表达于单核细胞、中性粒细胞、淋巴 细胞和PHA激活的T细胞，它是由352个氨基酸组成的GPCR，具有七次穿膜结构。CXCR4分 胞内区、跨膜区和胞外区。胞外区包括N端和3个胞外环，其中有两个潜在的糖基化位点和 四个半胱氨酸残基。其中的第二个胞外环对受体活性显示了重要的作用。CXCR4的糖基化位 点的作用是可遮盖与病毒包膜蛋白结合位点，但点突变对辅助受体活性并无太大影响。跨 膜区含一些脯氨酸残基，胞内区包括三个胞内环和富含丝氨酸和苏氨酸的高度保守序列， 并有一个G蛋白结合保守区。受体与配体结合后可能被磷酸化，并与G蛋白偶联。CXCR4参 与体内多种生理机制，包括参与造血功能，胚胎发育，及肿瘤迀移等，也是HIV-1入侵机体 细胞的主要辅助受体之一，在治疗艾滋病研究中是一个重要的药物靶点。 目前对艾滋病的治疗手段主要是控制HIV-1病毒的感染以及阻碍AIDS的发展，称 为高效抗逆转录病毒治疗法（highly active antiretroviral therapy，HAART)，包括一系 列抑制病毒各个繁殖阶段的化合物。HAART是能很大程度上减少细胞内病毒的繁殖和血浆 病毒血症的发生，但对于新的宿主细胞不被HIV-1感染没有作用。为了从源头上预防健康 的细胞被HIV-1感染，新的治疗方案需要彻底地破坏病毒的入侵途径，因而以CCR5为靶点 的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆 抗体、肽类化合物等。经典的CCR5拮抗剂抑制R5嗜性的HIV-1感染细胞的机制是：它们 与CCR5结合后，使CCR5构象改变，导致CCR5的内源化作用（internalization)或者不利 于HIV-1的识别，阻断HIV-1与细胞膜蛋白的结合，导致HIV-1与CCR5在细胞表面的结合 减少，从而起到抗感染的作用。但不幸的是长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐 药性，随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。同时， CCR5拮抗剂还存在如下缺点，例如，天然趋化因子的半衰期短和存在潜在的诱导炎症应答 作用；非肽类小分子化合物不能下调受体表达；肽类化合物不稳定、易降解；单克隆抗体存 在人体对药物的不适应性、潜在的过敏反应等缺点。 近年来，随着革巴向基因编辑技术的一步步突破，从ZFN(zinc finger nuclease) 到后来的 TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及最新的 CRISPR-Cas9技术，为艾滋病的彻底治愈提供了新的希望。研究表明带有CCR5编码基因 32 个核苷酸缺失的实验者接触HIV但未检测到HIV感染，表明了 CCR5影响HIV病毒入侵细胞， 说明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，因此能够实现CCR5在基因组层 面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗HIV的方法。2008年，Sangamo成功地利用ZFNs 在CD4+T细胞上实现CCR5的敲除，然而ZFN靶向敲除CCR5的效率较低，人们期待找到更高 效的CCR5的敲除策略。 规律成族间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一种具有核酸内切酶活性 的复合体，是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种免疫防御体系，用以对抗外来病毒 和外源DNA入侵。CRI SPR-cas9系统通过整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPR RNA(CRISPR_derived RNA，crRNA)和反式作用 RNA (trans-activating RNA，tracrRNA)特 异性地识别靶向序列，并对序列靶位点进行切割。在没有模板的条件下，发生非同源重组末 端连接（Non-homologous end joining，NHEJ)，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入 或缺失（indel)，造成移码突变，导致基因敲除。或者是在有同源模板的情况下，可通过另一 条同源重组（homologous recombination，HR)的修复途径进行修复，可实现对革E1向基因的 精确编辑，如引入特异突变或定点转基因。现在已经把两种小RNA (crRNA和tracrRNA)融 合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，因此，能够设计、制备出精确性和特异性 靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种嗜热链球菌CRISPR_Cas9系统识 别的靶序列以及精确特异地靶向人CXCR4基因的sgRNA和它们的有关应用。 因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种CRISPR_Cas9系统识别的 靶序列，所述靶序列如SEQ ID N0:1-63中任意一个的第n-20位所示且η = 1-5。 第二方面，本专利技术提供了一种sgRNA，该sgRNA的序列为：5'_识别序列-招募Cas9 蛋白的序列-3'，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID N0:l-63中任意一个的第 n-20位所示且η = 1-5。 第三方面，本专利技术提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。 第四方面，本专利技术提供了一种CRISP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CRISPR‑Cas9系统识别的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQ ID NO:1‑63中任意一个的第n‑20位所示且n＝1‑5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张竞方，秦小平，
申请(专利权)人：芜湖医诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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