本发明专利技术提供金针菇SSR分子标记及其对应引物与应用，金针菇SSR分子标记为序列表中SEQIDNO:1至SEQIDNO:13中的任意一个SSR位点；金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上开发的金针菇SSR引物具有序列表中SEQIDNO:14至SEQIDNO:39中所示的碱基序列。在已有金针菇基因组的基础上利用生物信息学方法对其基因组SSR位点进行检测并开发引物，利用不同金针菇菌株对这些SSR位点进行筛选后得到13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR分子标记可用于金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术属于分子生物学DNA分子标记
，具体涉及对金针菇不同菌株进行 鉴定的SSR标记方法，金针菇SSR分子标记及其对应引物序列的开发与应用。
技术介绍
： 金针燕 Flammulina velutipes 隶属于膨瑚菌科 Physalacriaceae 冬燕属 Flammulina，是我国主要栽培食用菌种类之一，2012年我国金针菇年产量240万吨，居世界 第一位。然而，目前我国金针菇产业大而不强，菌种问题成为金针菇产业发展的瓶颈，具体 表现为：在实际生产过程中常出现各单位引种途径不一，引种后各自取名、各自编号，出现 很多同物异名现象。不合理的引种、育种往往造成品种质量低劣，损害菇农利益，侵犯品种 权（张金霞等，2004;冯作山，2010)。为规范菌种开发和保护，开发一套快速有效的鉴别金 针菇不同品种的方法已成为当务之急。 目前，基于DNA序列的分子标记方法是DNA水平遗传多态性的直接反应，能有效对 近缘种或种下不同个体进行准确鉴别（Freeland，2005)。相较于其它分子标记方法，SSR分 子标记具有广泛分布于基因组的编码区及非编码区、共显性、多态性高、稳定性好、易于扩 增等优点。随着越来越多的物种的基因组被测序，基于基因组序列，运用生物信息学的方法 从基因组中直接开发SSR标记克服了基于实验手段开发SSR标记费时费力的缺点，该方法 成为目前开发SSR标记的主流方法。因此，利用已有的金针菇基因组数据开发高分辨率的 SSR标记对金针菇种质资源鉴定、保护及品种选育具有重要意义。
技术实现思路
： 本专利技术的目的在于提供一种对金针菇不同菌株进行准确鉴定的SSR标记方法，该 方法为金针菇的种质资源鉴定、保护及品种选育提供有力工具。 为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案： 金针菇SSR分子标记，其为序列表中SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:13中的任意一个 SSR位点。 在所述的金针菇SSR分子标记位点两端的侧翼序列上的金针菇SSR引物，其具有 序列表中SEQ ID N0:14至SEQ ID N0:39中所示的碱基序列。 如所述的金针燕SSR分子标记，其中所述金针燕SSR分子标记13个SSR位点在55 个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4. 2个，香浓多样性指数I平均值为0.821， 观测杂合度Ho平均值为0. 401，期望杂合度He平均值为0. 455,多态性信息含量PIC平均 值为0. 426,13个SSR位点在金针菇样本中具有较高的多态性。 如所述的金针燕SSR分子标记和金针燕SSR引物，其中所述的金针燕SSR分子标 记及对应SSR引物的的核苷酸序列如表1， 表1 SSR位点及引物序列 所述的金针菇SSR分子标记的开发方法，包括下述步骤：用生物信息学方法检测 金针菇基因组序列中的SSR序列，选取部分SSR序列进行引物开发，运用不同金针菇菌株进 行SSR位点的筛选，最终筛选出13对多态性较高的SSR分子标记，上述SSR标记及对应引 物的核苷酸序列如表1。 本专利技术还提供了所述的金针菇SSR分子标记和金针菇SSR引物在鉴别金针菇不同 品种中的应用。 所述应用是利用现有的金针菇基因组序列，用生物信息学方法检测其中的SSR位 点，选取部分SSR位点进行引物开发，用不同种类金针菇菌株进行SSR位点筛选出多态性较 高的SSR分子标记，通过运用不同SSR位点的荧光引物对不同种类的金针菇菌株的DNA进 行PCR扩增，然后将PCR产物运用ABI3730设备进行毛细管电泳，使用Genemapper软件分 析SSR数据，通过对SSR数据比对鉴定出不同种类的金针菇菌株。 对金针菇不同菌株进行鉴定的SSR标记及引物开发的方法，该方法包括下述步 骤：运用软件MISA和Primer3设计金针菇基因组SSR位点及其引物，运用改良的CTAB法提 取金针菇DNA，将所设计的SSR引物对金针菇DNA进行PCR扩增、检测。 如所述的对金针燕不同菌株进行鉴定的SSR标记方法，该方法具体包括下述步 骤： 所述的金针菇基因组SSR位点开发及引物设计是从NCBI上下载金针菇基因组数 据，运用软件MISA对其基因组SSR位点进行检测，运用软件Primerf对被检测到的SSR位 点在其上游及下游200bp范围内进行引物开发，引物开发条件为：引物长度在18bp-23bp之 间，引物TM值在57-62之间，GC含量在30 % -70 %之间。 所述的金针菇基因组提取及检测中总DNA提取用改进的CTAB法： (1)用接种刀刮取培养皿中的菌丝，放于2ml离心管中，加入少量石英砂、PVP和 350 μ 1在65°C下预热的4XCTAB提取液，提取液内含0. 2%的β -巯基乙醇，研磨，菌丝磨 匀后，再加入上述4 X CTAB提取液400 μ 1振荡混匀，在65°C水浴锅中温浴2~4h，30min摇 勾一次； (2)将温浴材料取出置于室温下，待其冷却到室温后加入750 μ 124 : 1氯仿-异 戊醇，摇匀，12000r/min下离心10min ; (3)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇，摇匀， 12000r/min 下离心 lOmin ; (4)将上清液转移到一新的2ml离心管中，加入80 %体积的异丙醇，预冷至-20°C， 充分混匀，于_20°C冰箱中放置1~2h ; (5)自冰箱中取出，恢复到室温后，12000r/min下离心15min，弃上清液； (6)用500 μ 1的70%的乙醇和无水乙醇各冲洗1~2次，每次12000r/min室温 离心lmin后弃上清液，然后将离心管置于37°C恒温箱中约20~30min，使乙醇充分挥发， 或者开盖使其自然干燥，干燥后加入灭菌的蒸馏水； (7)用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，将浓度调节至100ng/ μ 1，置于-20°C保存； 所述的SSR位点的PCR扩增检测是从上述筛选到的SSR位点中随机选取124个 位点对8个不同来源的金针菇菌株进行初步筛选，检测扩增条带的有无，PCR反应体系为： lOOng/μΙ 的DNA模板 lyl，25mg/ml BSA lyl，10XPCRBuffer2.5yl，dNTP10mm 0·5μ1， 正向引物5um ΙμL，反向引物5umlyl，Taq酶0·3μ1，（ΜΗ2015·7μ1，PCR反应条件为： 94°C :4min，（94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s) XSScyclesJ〗！： 8min，PCR 产物点样于 1%浓 度的琼脂糖胶中，放入1XTAE缓冲液中进行电泳检测，经检测有109对引物在8个金针菇 菌株中扩增出清晰明亮的条带，从中选取13对引物进行荧光引物合成，后将13对荧光引物 及55个金针菇菌株DNA样品进行荧光引物扩增，并用ABI3730xl设备检测扩增产物，使用 Genemapper软件分析、记录SSR数据； 所述的SSR位点遗传多样性信息计算是将获得的SSR数据运用PopGene32和PIC_ CALC软件进行各位点的遗传多样性指标及多态性信息含量计算，结果如表2,13个SSR位点 在55个金针菇样品中的等位基因数Na为2-8个，平均4. 2个，本文档来自技高网...
【技术保护点】
金针菇SSR分子标记，其特征在于其为序列表中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:13中的任意一个SSR位点。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓斌，李静，冯邦，杨祝良，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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