一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用，该嗜热栖热菌漆酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。编码上述漆酶的DNA序列如Seq No.1所示。该DNA可在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中应用。重组毕赤酵母工程菌是将表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)获得。重组漆酶是将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。该重组漆酶具有漆酶活性和耐高温特性，可在染料脱色中应用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脱色作用，脱色率甚至可以达到100％。

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热栖热菌漆酶及工程菌、重组漆酶和应用
本专利技术涉及生物
和环境生物领域，特别涉及一种嗜热栖热菌漆酶基因和该基因工程菌和该基因编码的漆酶在生物酶法处理纺织废水中的应用。
技术介绍
漆酶(benzenediol:oxygenoxidoreductases,EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶(MCOs)家族，广泛分布在植物、真菌、少数细菌和昆虫中。漆酶的活性中心一般包含4个铜离子，漆酶的催化氧化反应即通过铜离子间的协同传递电子，夺取反应底物的电子，将底物氧化为自由基形式，同时将从底物捕获的电子传递给O2，将O2还原为水。漆酶作用的底物相当宽泛，典型的底物是各种酚类化合物及其衍生物，包括简单的二酚、多酚、甲氧基取代酚(如愈创木酚)、氨基酚、氯酚等。在小分子的介体物质存在下，漆酶可氧化的底物范围还将进一步扩大。由于漆酶具有降解木质素与有毒酚类物质的作用，使得漆酶在工业上有重要的应用价值，包括工业染料脱色、土壤和水体的生物除污、纸浆漂白、食品和果汁加工等方面。目前研究比较多且深入的漆酶大多是真菌漆酶。但真菌漆酶的工作pH一般在酸性范围，热稳定性较差，而且对氯离子比较敏感，在高浓度氯离子环境下容易失去活性。这些缺点使真菌漆酶在某些工业应用领域受到一定的限制。而细菌漆酶的工作pH一般在中性到碱性范围，热稳定性好，且它们中有不少对氯离子有较高的耐受性。印染、纺织工业的废水排放量巨大，而且未经处理的废水严重污染环境。来自印染、纺织工业的废水的pH值一般在中性到碱性，含有高浓度氯化物、金属离子、表面活性剂和合成染料等复杂成分。其中高含量的工业染料可能对水体生物具有毒性，降低水体能见度，同时增加水体生物需氧量(BOD)。大部分的工业染料都难以被微生物降解，使用物理或者化学方法往往成本高而且效果不佳。生物法，比如利用漆酶、锰过氧化物酶等，对一些工业染料的脱色率高且环保。因此，具有碱性工作pH以及对高浓度氯化物具有高耐受性的细菌漆酶在印染、纺织废水脱色处理中具有独特的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于克服现有技术中的不足，提供一种来源于嗜热栖热菌Thermusthermophilus的漆酶基因。本专利技术按照毕赤酵母密码子偏好性对漆酶基因进行优化，并通过全基因合成得到该漆酶基因核酸序列，该漆酶基因的核酸序列如SeqNo.1所示,氨基酸序列如SeqNo.2所示。该漆酶基因能够在毕赤酵母(Pichiapastoris)实现高效表达。上述漆酶基因在构建巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统中的应用，将上述漆酶基因及其调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中，具体包括如下步骤：(1)将权利要求2所述DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-lacTT；(2)通过将表达载体pHKFA1-lacTT化学转化E.coliTop10得到克隆菌株E.coliTop10/pHKFA1-lacTT。一种重组毕赤酵母工程菌，将权利要求5所述表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)获得。上述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：将表达载体pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)GS115感受态细胞，并在MD平板进行阳性转化子筛选；以MD平板筛选得到的转化子为模板，以TTF和TTR为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子为重组毕赤酵母工程菌PichiapastorisGS115/pHKFA1-lacTT，其中TTF和TTR的序列如SeqNo.3、4所示。一种重组漆酶，将上述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得。其构建方法如下：挑取重组毕赤酵母工程菌接种到BMGY培养基，30℃，250rpm培养至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃离心5min收集细胞，然后将收集的细胞重悬到BMMY培养基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震荡培养，每天补加终浓度1％甲醇；发酵六天后在6000rpm，4℃离心5min回收发酵上清液；用亲和层析方法对发酵上清液的重组漆酶进行纯化即可；所述BMMY培养基中含有0.1mMCuSO4。上述重组漆酶可在染料脱色中应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)本专利技术的漆酶具有漆酶活性。同时还对获得的重组漆酶进行最适作用pH、pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果显示该重组漆酶的温度稳定性和pH稳定性非常好，表明该漆酶具有非常好的耐热耐碱能力。(2)本专利技术还涉及氯离子对获得的重组漆酶的影响分析，结果显示该重组漆酶对氯离子有非常高的耐受性。(3)本专利技术的重组漆酶来源于嗜热栖热菌Thermusthermophilus，在成功地将这个新发现的漆酶基因在毕赤酵母中异源表达的基础上，对这个酶蛋白进行纯化和酶学性质研究，结果显示，该重组漆酶对碱性环境和NaCl有较高的耐受性，且具有耐高温的特点。此外，实现了该漆酶在生物酶法处理纺织废水中的应用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脱色作用，脱色率甚至可以达到100％。附图说明图1为纯化漆酶的(a)SDS-PAGE分析及(b)活性染色图；(a)SDS-PAGE图谱，其中M：标准蛋白质分子量；1：加热变性的纯化重组漆酶；2：未经加热变性的纯化重组漆酶；(b)活性染色图，其中M：标准蛋白质分子量；1：非变性纯化漆酶与底物SGZ发生显示反应；2：非变性纯化漆酶与底物愈创木酚发生显示反应。图2为纯化重组漆酶的(a)最适pH曲线和(b)pH稳定性曲线。图3为纯化重组漆酶的最适温度曲线和温度稳定性曲线。图4为不同浓度的NaCl对纯化重组漆酶的影响。图5为纯化重组漆酶在磷酸钠缓冲液pH7.5(刚果红脱色pH环境是pH8.0)对3种偶氮类和一种蒽醌类染料的脱色作用。图6为漆酶脱色处理前后四个合成染料的全波长扫描分析:(a)RB5；(b)RBWNN；(c)RBBR；(d)CR。具体实施方式下面结合具体制备实施例和应用实施例，对本专利技术作进一步详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1新型漆酶基因的合成以美国国立生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的GenBand:YP_005641270.1氨基酸序列为基础，对该序列按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，得到新型漆酶基因，其序列如SEQIDNO.1所示，通过生物技术公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)全基因合成，合成的基因克隆在pUC57质粒(购自金斯瑞生物科技公司)上，得到质粒pUC57-lacTT。实施例2含新型漆酶基因的重组质粒pHKFA1-lacTT及携带该质粒的菌株E.coliTop10/pHKFA1-lacTT的构建根据新型漆酶基因的核苷酸序列设计PCR引物：正向引物TTF：5'-GGAATTCAATACCGATAGAAGAACCCT-3'(下划线为EcoRI酶切位点)和反向引物TTR：5'-ATTTGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCCGACTTCCAAAACTCC-3'(下划线为NotI酶切位点，同时含有8×His标签和终止密码子)。以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜热栖热菌漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如Seq No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组漆酶在染料脱色中的应用，其特征在于，所述的染料是偶氮染料和蒽醌染料，所述重组漆酶的制备方法包括如下步骤：(1)将如SeqNo.1所示的DNA连入到巴斯德毕赤酵母表达载体pHKFA1，得到表达载体pHKFA1-lacTT；(2)通过将表达载体pHKFA1-lacTT化学转化E.coliTop10得到克隆菌株E.coliTop10/pHKFA1-lacTT；(3)将步骤(2)所述表达载体pHKFA1-lacTT线性化后转化毕赤酵母(Pichiapastoris)获得重组毕赤酵母工程菌；(4)将所述重组毕赤酵母工程菌进行发酵获得重组漆酶。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌的构建方法如下：将表达载体pHKFA1-lacTT经Kpn2I单酶切线性化并纯化后电转化毕赤酵母工程菌(Pichiapastoris)GS115...

【专利技术属性】
技术研发人员：林影，刘慧平，梁书利，韩双艳，郑穗平，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44