一种克隆山羊IGFBP2基因编码区全序列的方法技术

本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种克隆IGFBP2基因编码区全序列的方法。其编码区核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。本发明专利技术还公开了一种山羊IGFBP2基因克隆的方法，包含以下步骤：步骤一，提取山羊肝脏组织中的总RNA，然后将其反转录成cDNA；步骤二，扩增引物的设计及PCR反应；步骤三，扩增产物的回收和纯化；步骤四，克隆。采用上述方案，本发明专利技术首次获得了山羊IGFBP2基因完整的编码区序列，提交GenBank获得的登录号为JQ341160，该发明专利技术也为进一步研究山羊的该基因奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
-种克隆山羊IGFBP2基因编码区全序列的方法
本专利技术涉及动物基因工程
，更具体地说涉及一种从山羊肝脏组织中克隆 IGFBP2 (Insulin-like growth factor binding protein 2)基因编码区全序列的方法。
技术介绍
畜禽的生长发育受到神经内分泌生长轴的调控，对于哺乳动物而言，主要依赖下 丘脑-垂体-靶器官通路来完成。而胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs)和胰岛素样生 长因子（IGFs)之间作为其中的一个生长调控轴，对于调控动物的生长和发育具有重要的作 用和意义。IGFBPs跟IGFs的结合能够正向或负向调节IGFs的生物活性从而实现其生物 功能。IGFBPs调节IGFs的生物学功能主要表现在：（1)在血液中作为转运蛋白运输IGFs ; [2] 延长IGFs的半衰期并调控它们的代谢清除率；（3)运输IGFs到特定的组织和细胞发 挥作用；（4)通过调节IGFs与其受体间的相互作用，影响IGFs的生物学活性。体内循环的 IGFBPs可以和IGFs形成二聚复合物，通过毛细血管内皮，将IGFs转运至靶组织，通过第二 信使发挥IGFs的促合成代谢作用，从而达到促进动物生长的作用。由此可见，IGFBPs在动 物的生长发育过程中起到至关重要的作用。 RT-PCR克隆：是将RNA的反转录（RT)和CDNA的聚合酶链式反应以及分子克隆相 结合的一种技术。首先利用反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增我们需要 的目的基因片段，然后将此片段与载体连接转化到感受态细胞中进行克隆，获得的质粒PCR 产物进行测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化 和连接酶处理，能够快速获得其它依靠限制性内切酶消化法难于得到的PCR产物；同时该 方法能克服普通PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE (cDNA 末端快速扩增）技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本较低，工作量小。该技术 的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计正向引物，在终止密码子的下游设计 反向引物，使得PCR产物能包含完整的基因编码区全序列。 获得目的基因编码区序列一般采用克隆或RACE技术，RACE技术是基于PCR技术 基础上由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端。但该 技术与克隆技术相比，目的基因片段的长度不明确，试验成本高，工作量大，对于提取的RNA 质量要求较高，因此应用相对较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简单、快速获取山羊IGFBP2基因完整编 码区序列的方法，填补在山羊上该基因研究的空白，为进一步研究其在山羊上的功能奠定 基础。 本专利技术采用以下技术方案： 一种克隆山羊IGFBP2基因编码区全序列的方法，包括以下步骤： A1、从山羊肝脏组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ; A2 :以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计 引物； A3 :以cDNA为模板进行PCR扩增； A4 :扩增产物的胶回收和纯化； A5 :纯化的产物进行克隆与测序，即能得到山羊IGFBP2基因的编码区全序列。 所述的方法，步骤Al包括以下步骤：取用液氮研磨好的组织粉末约80mg，加入预 先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混匀后，室温静置5min ;加氯仿0. 2mL(必须按总体积 的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min ;4°C下12000rpm离心15min ;转移上层水 相45〇μ?于另一个新的I. 5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置IOmin ;4°C 下12000rpm离心IOmin ;弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制） ImL,静置5η?η，4·?下7500g离心5min ;弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min ;力口 入3〇μ? DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA，然后立即反转录成cDNA。 所述的方法，步骤A2中引物为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。 【附图说明】 序列表SEQ ID NO: 1，山羊IGFBP2基因核苷酸序列。 序列表SEQ ID NO:2,山羊IGFBP2基因编码的氨基酸序列。 图1是山羊IGFBP2基因的PCR产物电泳图。 图2是山羊IGFBP2基因编码区的核苷酸序列和预测的氨基酸序列。 【具体实施方式】 以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。 具体实施步骤： 1、组织样的采集 选取出生后120d的南江黄羊进行宰杀，取其肝脏组织样品后迅速置于液氮中保存待 用。 2、总RNA的提取和cDNA的合成 (1) 取用液氮研磨好的组织粉末80mg，加入预先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混勻 后，室温静直5min ; (2) 加氯仿0. 2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min ; (3) 4°C下 12000rpm 离心 15min ; (4) 转移上层水相45〇μ?于另一个新的I. 5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后 室温静置IOmin ; (5) 4?下 12000rpm 离心 IOmin ; (6) 弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制）lmL，静置5min， (7) 4°C下 7500g 离心 5min ; (8) 弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min ;加入3〇μ? DEPC处理水，吹打混 匀，充分溶解RNA。 (9)用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的质量，效果好的立即反转录成cDNA。 3、目的基因片段的扩增 (1) 引物的设计：根据GenBank数据库中公布的绵羊（6￥i5· aries )的IGFBP2 (NM_001009436)基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，设计的引物为： 正向引物：5' ACCACCATGCAGCCGAGACT 3' 反向引物：5' CATGTCAGAACTCCTGGAAGC 3' (2) PCR的反应体系和条件：反应体系（25μυ :0. 25 μ?的TaKaRa Taq酶，12. 5 μ?的 2XGC Buffer I，4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6.25 μ? 的灭菌 CldH2O，模板 cDNA 1 μ?。反应条件为 95°C预变性 4 min，35 个循环（94°C，45 s;5L3°C，30 s;72°C，90 s)，最后72°C 7 min ;PCR产物用I. 5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。 4、PCR产物的回收和纯化 PCR产物用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收，具体步骤为： (1)通过1. 5%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净 的手术刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入I. 5 mL离心管中。 (2)称量凝胶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克隆山羊IGFBP2基因编码区全序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

【技术特征摘要】
1. 一种克隆山羊IGFBP2基因编码区全序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所述。2. 根据权利要求1所述，扩增IGFBP2基因片段的正、反向引物的DNA序列如下所示： 正向引物：5' ACCACCATGCAGCCGAGACT3' 反向引物：5' CATGTCAGAACTCCTGGAAGC 3' 制备如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：占思远，张红平，李利，仲涛，王林杰，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51