纯化和利用来自超嗜热菌的无机焦磷酸酶的系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了编码超嗜热菌焦磷酸酶蛋白的核酸SEQIDNO：1或3的核酸，酶蛋白SEQIDNO:2或4，以及用分离的超嗜热菌焦磷酸酶蛋白测序的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了纯化和利用无机焦磷酸酶的系统、方法、试剂和试剂盒。更具体地，本专利技术涉及无机焦磷酸酶的有效分离及其在核酸扩增和测序技术中的用途。
技术介绍
许多扩增和测序策略采用聚合酶用于将核苷酸种类(nucleotide species)添加至新合成的核酸分子。通常理解的是，对于聚合酶掺入的每种核苷酸种类，焦磷酸分子(通常也被称为“PPi”)和氢分子被释放进反应环境中。这可以是采用非常小的反应环境的扩增和测序策略中的非常重要的考虑，因为经过聚合酶的许多掺入事件，PPi分子在反应环境中聚集，达到一定浓度，在该浓度时PPi对聚合酶掺入核苷酸种类的能力具有抑制作用。 此外，存在依赖于检测PPi释放的能力的测序技术。例如，可以采用测定释放的PPi的相对量或PPi浓度的改变来表示与模板分子的序列位置的核苷酸种类互补的核苷酸种类的掺入。检测或测定的模式可以包括反应环境中PH的改变，或者通过产生对于每个掺入的核苷酸分子的光的光子的酶级联反应，这通常被称为“焦磷酸测序(Pyrosequencing) ”。在本例子中,测定的PPi的程度与掺入的核苷酸分子的数量是直接成比例的，因此，对于此处所述的测序策略非常重要的是，在核苷酸引入步骤(即下面进一步讨论的核苷酸流(nucleotide flow))中检测的PPi是该步骤期间从该特定的核苷酸掺入所释放的结果，而不是来自前一步骤的残留分子。因此，降低PPi的浓度或将其从反应环境完全去除的策略在所述的扩增和测序背景中是非常期望的。通常，这可以通过使用与PPi分子反应并使之特异性降解的焦磷酸酶(PPi-ase)来完成。以前鉴定的分离的焦磷酸酶试剂的形式包括源自超好热性古细菌(Thermococcus 7iiora7i5·)的种类，可以从 New England Biolabs, Inc.(也被称为 NEB,Ipswich Massachusetts)获得。然而，仍然需要表现出用于在扩增和测序技术中使用所需的特征的其它分离的焦磷酸酶试剂种类。专利技术概述 本专利技术的实施方案涉及核酸序列的测定。更具体而言，本专利技术的实施方案涉及用于校正在通过边合成边测序(sequencing by synthesis (SBS))的核酸测序期间获得的数据中的错误的方法和系统。描述了核酸的实施方案，其包括编码超嗜热菌(Aae)焦磷酸酶蛋白的核酸SEQ IDN0:1或3。在优选的实施方案中，核酸编码His标签。在进一步优选的实施方案中，核酸编码BCCP生物素化位点。此外，描述了使用分离的焦磷酸酶蛋白的测序方法的实施方案，其包括如下步骤在包含源自超嗜热菌(Aquifex aeolicus)物种的酶蛋白SEQ ID NO :2或4的反应环境中进行测序反应，其中所述酶蛋白包括焦磷酸酶活性。在优选的实施方案中，酶蛋白结合于珠子。在进一步优选的实施方案中，酶蛋白通过生物素连接结合于珠子。在仍进一步优选的实施方案中，使用体内过程将生物素有效地偶联于蛋白。在仍进一步优选的实施方案中，酶蛋白是热稳定的。在仍进一步优选的实施方案中，在多个反应环境中同时进行多个测序反应。上述实施方案和实施方式不必彼此包容或排斥，可以以不冲突的以及可能的其它任何方式组合，无论它们是否与相同的或不同的实施方案或实施方式存在。实施方案或实施方式的描述并不意在限制其它实施方案和/或实施方式。而且，在本说明书中其它地方所述的任何一种或多种功能、步骤、操作或技术可以在其它实施方式中与摘要中所述的任何一种或多种功能、步骤、操作或技术相结合。因此，上述的实施方案和实施方式是说明性的而非限制性的。附图简要说明 当与附图相结合时，可以从下面详细的描述中更清楚地理解上述的进一步的特征。在附图中，相同的参照数表示相同的结构、元件或方法步骤，参照数的最左边的数字表示参照元件首次出现的图中的数字(例如，元件160首先出现在图I中)。然而，所有这些规则的本意是典型性的或说明性的，而非限制性的。图I是在计算机控制下的测序仪和反应底物的一种实施方案的功能方框 图2是超嗜热菌焦磷酸酶融合分子的一种实施方案的简化的图例； 图3A和3B是超好热性古细菌(7 Iitoralis)的一种实施方案和超嗜热菌焦磷酸酶的一种实施方案的活性水平的比较的简化的图例； 图4是超嗜热菌焦磷酸酶的一种实施方案所示的热稳定性的简化的图例； 图5A和5B是用结合于珠子的超好热性古细菌焦磷酸酶的一种实施方案和超嗜热菌焦磷酸酶的一种实施方案在珠子上从大肠杆菌获得的测序结果的比较的简化的图例； 图6A和6B是用结合于珠子的超好热性古细菌焦磷酸酶的一种实施方案和超嗜热菌焦磷酸酶的一种实施方案在珠子上从空肠弯曲菌Γ6；获得的测序结果的比较的简化的图例；和 图7A和7B是用结合于珠子的超好热性古细菌焦磷酸酶的一种实施方案和超嗜热菌焦磷酸酶的一种实施方案在珠子上从极端嗜热菌Γ7获得的测序结果的比较的简化的图例。专利技术的详细描述 正如下面将更详细描述的，本专利技术的实施方案包括用于源自超嗜热菌的焦磷酸酶的纯化的分离的核酸序列、蛋白序列和/或产物、表达系统、方法和试剂盒以及该酶的用途。具体而言，本专利技术的实施方案涉及编码焦磷酸酶的分离的焦磷酸酶核酸序列以及由其衍生的融合序列，该融合序列包括实现处理步骤如纯化和/或生物素化的一个或多个元件，尤其可用于核酸模板分子的扩增以及可用于高通量核酸测序技术中。a. P、体 术语“流程图(flowgram)”通常是指SBS方法、尤其是基于焦磷酸盐的测序方法(也被称为“焦磷酸测序”)产生的序列数据的图示，可以更特异性地称为“焦磷酸图(pyrogram)”。此处所用的术语“阅读(read)”或“序列阅读(sequence read)”通常是指从单一核酸模板分子或者模板核酸分子的多个基本上相同的拷贝的群体获得的整个序列数据。此处所用的术语“运行(run) ”或“测序运行(sequencing run) ”通常是指在一个或多个模板核酸分子的测序操作中进行的一系列测序反应。此处所用的术语“流(flow) ”通常是指将溶液添加至包含模板核酸分子的环境的一系列或重复的循环，其中所述溶液可以包括用于添加至新生分子或其它试剂如缓冲液或酶的核苷酸种类，该缓冲液或酶可以用于测序反应中，或用于从核苷酸种类的前面的流循环中减少延滞效应(carryover effects)或噪声效应(noise effects)。此处所用的术语“流循环(flow cycle) ”通常是指一系列连续的流，其中在循环期间核苷酸种类流动一次(即，流循环可以包括以Τ、A、C、G核苷酸种类的顺序的连续添加，尽管其它序列的组合也被认为是定义的一部分)。通常，流循环是从循环到循环具有相同流的序列的重复循环。此处所用的术语“阅读长度(read length) ”通常是指可以被可靠地测序的模板分子的长度的上限。有许多对系统和/或方法的阅读长度有贡献的因素，包括但不限于模板核酸分子中的GC含量的程度。此处所用的术语“测试片段(test fragment)”或“TF”通常是指已知序列组成的核酸元件，该元件可以用于质量控制、校准或其它相关的目的。 此处所用的术语“引物”通常是指在一定条件下作为DNA合成的起始点的寡核苷酸，在该条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D格拉塔洛，KH林克，L皮诺，P桑冈，SG舍诺伊，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：
国别省市：