以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂及应用，属于烟草复烤前添加的可提高烟草品级的酶制剂。本发明专利技术酶制剂的酶活力在50℃和pH4.5下为3000 U/mL～4000U/mL，优选3500U/mL，该酶活力是在稀释缓冲液中加有Ca(NO3)2、MgSO4、ZnSO4和 FeSO4恢复酶活性后测定的。制备：以市售的酸性木聚糖酶为制备酶源，用加有PMSF的Britton-Robinsion缓冲液并加入NaCl搅拌溶解，过滤，收集滤液，再用 (NH4)2SO4浓度分次沉淀、离心，收集沉淀，并进一步去除金属离子和冰冻浓缩等。应用：以聚戊糖含量在11%～19%的烟草作为适宜的处理对象，稀释制剂250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于烟草复烤前添加的可提高烟草品级的酶制剂。技术背景木聚糖酶（xylanase）是专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要有：①β-1,4-D-木聚糖内切酶（EC3.2.1.8），简称木聚糖酶，功能是水解木聚糖主链内部的1,4-糖苷键作用于木聚糖无侧枝区产生低聚糖和有侧枝的寡聚糖，水解产物主要是木二糖和木寡糖，可使木聚糖溶液的粘度迅速下降。②β-1,4-D-外切木聚糖酶（EC3.2.1.92），从木聚糖的非还原性末端，以单个木糖单位（糖基）为切割单位，水解将木糖残基（糖基）使之成为木糖，使反应体系因木糖量的增加而还原性也增加。③β-D-木糖苷酶（EC3.2.1.37）为外切酶，是木聚糖类半纤维素彻底降解为单糖的关键酶之一，从木聚糖水解后的产物低聚木糖和木二糖的非还原性末端逐一水解切下木糖苷单位形成木糖。该酶能够水解对-硝基苯-β-D-木糖基（PNPX）等人工底物。因β-1,4-木聚糖外切酶（EC3.2.1.92)也能水解低聚木糖和木二糖使木聚糖彻底降解为木糖，在这点上与β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）同属外切酶的功能相同。在多数资料中未将两种酶分列说明，仅少数资料明确β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）是水解低聚木糖和木二糖的。木糖苷酶存在于细菌和真菌中，一般不分泌到细胞外为胞内酶（刘士清，张无敌，尹芳，等。沼气发酵实验教程。北京：化学工业出版社，2013，p114-126，127-138）。大多数微生物产生的木聚糖酶的最适作用pH值在6～7，其中一些微生物能够产生在较低pH条件下保持较高酶活力和稳定性的耐酸或酸性木聚糖酶，即酸性木聚糖酶，这些微生物的木聚糖酶显示的酸稳定性，提供了以工业化生产的微生物酸性木聚糖酶市售商品的来源（田永，等，酸性木聚糖酶的应用研究进展，粮油加工，2008，(5):110～113）。相关专利文献中，“一种复合酶制剂及将该复合酶制剂用于烟梗生产的工艺”(戴丽君等，ZL2005101044436)研究了淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶复合酶制剂，经复合酶处理后的烟梗、梗膏和再造烟叶的水溶性糖含量有较大的变化。但不是单一的酸性木聚糖酶制品。
技术实现思路
本专利技术旨在提供以商品化的酶源制备单一的酸性木聚糖酶，用于新鲜烟草烘烤后，对复烤前的片烟用水稀释替代片烟复烤的自然陈化时原有的第二润叶用水的烟草活性添加剂，更好地降解烟草中的半纤维素，达到提高烟草品质的作用。本专利技术上述目的通过以下方法实现：（一）以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂该制剂酸性木聚糖酶的酶活力在50℃和pH4.5下为3000～4000U/mL。优选的，所述的酶制剂的酸性木聚糖酶的最佳酶活力为3500U/mL。（二）制备本专利技术辅助酶制剂的方法包括以下步骤：（1）用pH4.5缓冲液溶解蛋白酶活性抑制剂PMSF，PMSF在缓冲液中的浓度为0.01mol/L，再按缓冲液与水的体积比1：4稀释缓冲液；将市售的酸性木聚糖酶固体物酶源与稀释缓冲液该两者按重量体积比1g：10～20mL混匀得混合液，加入NaCl搅拌溶解，混合液与NaCl的重量体积比为0.75g/L；过滤，收集滤液作为待精制处理的粗酶液，静置。上述缓冲液为Britton-Robinsion缓冲液；上述在市售的酸性木聚糖酶固体物酶源中加入pH4.5的稀释缓冲液的量与酶源的原始酶活力呈正相关；（2）步骤（1）静置1h的粗酶液，加入(NH4)2SO4，(NH4)2SO4浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h；继续按上清液体积加入(NH4)2SO4浓度为至80%，静置过夜。离心要沉淀。收集的上清液中补加10%(NH4)2SO4，再过夜，重复离心得二次沉淀，合并两次沉淀；所述(NH4)2SO4浓度为重量体积比；（3）配制浓度为0.1%的EDTA溶液，该溶液与沉淀的体积比为1：2；将步骤（2）收集的沉淀与pH4.5的稀释缓冲液按体积比2：1混匀后加入以上EDTA溶液，静置，离心，得到去除金属离子的酶上清液；（4）往酶上清液加入浓度为0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液与蔗糖低聚物的体积比为100︰1，作为初制品，-8℃冷冻干燥浓缩至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力为3000～4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂，其中，浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂的最佳酶活力为3500U/mL；所述蔗糖低聚物浓度为重量体积比。所述步骤（1）中的酶源原始酶活力5，000U/g，酸性木聚糖酶固体物与pH4.5的稀释缓冲液该两者按重量体积比1g：10mL：酶源的原始酶活力10，000U/g，酸性木聚糖酶固体物与pH4.5的稀释缓冲液该两者按重量体积比1g：20mL。所述步骤（4）中可以浓度为0.01%的β-环糊精替代蔗糖低聚物，酶上清液与β-环糊精的体积比为100︰1，作为初制品，-8℃冷冻干燥浓缩至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力为3000～4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶原液制剂。进一步，其中原液制剂的酶活力是以pH4.5的稀释缓冲液中加有Ca(NO3)2、MgSO4、ZnSO4和FeSO4，其中，Ca(NO3)2、MgSO4、ZnSO4和FeSO4分别与缓冲液的重量体积比为0.3g/100mL，以恢复酸性木聚糖酶酶活力，及在50℃下所测定的酶活力。（三）应用酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂的方法该酶制剂以戊聚糖含量在11%～19%的烟草作为适宜的处理对象。所述的应用方法是：将酶活力为3000～4000U/mL的浓缩的酸性木聚糖酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的酶活力范围为12～16U/mL。优选的，所述的应用方法是：将酶活力为3500U/mL的浓缩的酸性木聚糖酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酸性木聚糖酶酶活力为14U/mL。本专利技术的进步及意义是：本专利技术中所用的起始酶源主要来源于市售的酸性木聚糖酶商品，该商品的酶活力为5000U/g或10000U/mL，价格低，来源广。本专利技术产品为单一的酸性木聚糖酶产品，质量有保障、应用易控制，效果稳定和良好。本专利技术以商品酶生产酸性木聚糖酶，商品酶源中有调制稳定其质量的填充物等；酶源中还存在的金属离子、酶及蛋白质等杂物，这些杂物破坏了酸性木聚糖酶的产品质量及处理烟草的效果，本专利技术通过纯化、浓缩的精制工艺尽可能地除去杂物，作为用于烟叶烘烤后，在复烤前的加工过程中辅助添加的酶制剂。本专利技术烟草活性添加剂为一种能破坏烟叶中细胞壁，降解半纤维素，改善与提高烟草品质的单一酸性木聚糖酶，酸性木聚糖酶的酶活力在3000～4000U/mL，最佳酶活力为3500U/mL，性状为浓缩液酶制剂，适用于处理烟叶中戊聚糖（半纤维素）含量在11%～19%范围内不同等级和不同产地的大多数品种烟草。本专利技术使用时将产品用水稀释250倍，代替片烟复烤时的第二次润叶用水，极其简易，改善烟叶内在品质本文档来自技高网...
【技术保护点】
以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂，其特征是：该制剂酸性木聚糖酶的酶活力在50℃和pH4.5下为3000～4000U/mL。
【技术特征摘要】
1.以市售的酸性木聚糖酶制备烟草加工的辅助酶制剂，其特征是：该制剂酸性木聚糖酶的酶活力在50℃和pH4.5下为3000～4000U/mL。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征是：该制剂酸性木聚糖酶的最佳酶活力为3500U/mL。
3.制备如权利要求1～2之一种所述的以酸性木聚糖酶作为烟草加工辅助添加的酶制剂的方法，包括以下步骤：
（1）用pH4.5缓冲液溶解蛋白酶活性抑制剂PMSF，PMSF在缓冲液中的浓度为0.01mol/L，再按缓冲液与水的体积比1：4稀释缓冲液；将市售的酸性木聚糖酶固体物酶源与稀释缓冲液该两者按重量体积比1g：10～20mL混匀得混合液，加入NaCl搅拌溶解，混合液与NaCl的重量体积比为0.75g/L；过滤，收集滤液作为待精制处理的粗酶液，静置；
上述缓冲液为Britton-Robinsion缓冲液；
上述在市售的酸性木聚糖酶固体物酶源中加入pH4.5的稀释缓冲液的量与酶源的原始酶活力呈正相关；
（2）在步骤（1）静置1h的粗酶液中加入(NH4)2SO4，(NH4)2SO4浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h；继续加入(NH4)2SO4浓度至80%，静置过夜，离心得到第一次沉淀；所得上清液则补加10%的(NH4)2SO4静置过夜后，再离心得第二次沉淀，合并以上两次沉淀；
所述(NH4)2SO4浓度为重量体积比；
（3）配制浓度为0.1%的EDTA溶液，该溶液与沉淀的体积比为1：2；
将步骤（2）收集的沉淀与pH4.5的稀释缓冲液按体积比2：1混匀后加入以上EDTA溶液，静置，离心，得到去除金属离子的酶上清液；
（4）往酶上清液加入浓度为0.01%的蔗糖低聚物，酶上清液与蔗糖低聚物的体积比为100︰1，作为初制品，-8℃冷冻干燥浓缩至初制品的1/8～1/10倍，得酶活力为3000～4000U/mL浓缩的酸性木聚糖酶制剂，其中，浓缩的酸性木聚糖酶制剂的最佳酶活力为3500U/mL；
所述蔗糖低聚物浓度为重量体积比。
4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩伟，黄文荣，刘士清，张无敌，尹芳，陈应昆，何宝玉，赵春雷，雷宇，王金浩，王应中，韩梦璇，赵刚，
申请(专利权)人：云南万芳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。