一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加剂制造技术

本发明专利技术公开了一种酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)工程菌，其是将猪防御素pBD2成熟肽的编码序列和酿酒酵母信号肽的编码序列克隆到酿酒酵母表达载体上，得到重组载体，将该重组载体转化入酿酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。本发明专利技术通过构建酿酒酵母工程菌，在酿酒酵母中转入具有抑菌功能的猪防御素基因，使酿酒酵母也具有了抑菌功能，为酵母更好的在畜牧养殖业中发挥作用奠定了新的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程菌领域，涉及一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加剂。
技术介绍
酿酒酵母是一类单细胞微生物，结构简单，属于真菌类。酿酒酵母具有个体大，蛋白质含量高，杂食性强，易分离，易培养，代谢产物多，综合利用广等特点，在饲料工业中得到了广泛研究和应用。酵母可以改善动物胃肠道环境和菌群结构，增强动物免疫力，对幼年动物可刺激其胃肠道发育，并且，酵母可以产生一些生长因子，促进动物生长，因此是一类具有极高应用价值的饲料添加剂。但是酵母和饲用乳酸菌、芽孢杆菌等益生菌相比，缺少对有害菌的抑菌能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酿酒酵母工程菌，其构建方法与应用。本专利技术所提供的酿酒酵母工程菌，其是将猪防御素pBD2成熟肽的编码序列和酿酒酵母信号肽的编码序列克隆到酿酒酵母表达载体上，得到重组载体，将该重组载体转化入酿酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。其中，所述酿酒酵母为酿酒酵母YS58。其中，所述酿酒酵母表达载体为pAURl 23。在本专利技术的一个实施方案中，所述猪防御素PBD2成熟肽序列是指pBD2的26 69位氨基酸序列，所述酿酒酵母信号肽序列是指克隆自毕赤酵母表达质粒pPICZ a A的第941-1207位基因编码的89个氨基酸残基的酿酒酵母信号肽序列。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述的酿酒酵母工程菌的保藏编号为CGMCCN0.6921。本专利技术还提供所述的酿酒酵母工程菌的方法，将编码猪防御素pBD2成熟肽的DNA序列和编码酿酒酵母信号肽的DNA序列克隆入酵母表达载体PAUR123，得到具有抑菌功能的酿酒酵母工程菌，所述猪防御素PBD2成熟肽序列为猪防御素pBD2的26 69位氨基酸序列，所述酿酒酵母信号肽序列为克隆自毕赤酵母表达载体的含有89个氨基酸残基的酿酒酵母信号肽序列。在本专利技术一个实施方案中，通过PCR扩增出猪防御素PBD2基因编码第26 69位氨基酸的基因序列，通过扩增引物在基因5’端导入KpnI酶切位点，3’端导入SacI酶切位点，用KpnI和SacI将扩增的pBD2基因双酶切后，连接在酵母表达载体pAUR123的KpnI和SacI酶切位点上，构建得到pABD2质粒；通过PCR方法扩增毕赤酵母表达质粒pPICZ a A的酿酒酵母信号肽序列的第941-1207位基因，并通过引物在序列两端引入KpnI酶切位点；将PABD2质粒用KpnI单酶切，将P CR得到的信号肽序列插入pABD2质粒中，得到pABD2a质粒；将pABD2a质粒转化入酿酒酵母YS58菌株中，通过AbA抗性筛选得到具有抑菌活性的酿酒酵母。本专利技术提供所述的酿酒酵母工程菌在饲料添加剂上的应用。本专利技术的酿酒酵母工程菌可以单独或与其它有益微生物配伍，作为添加剂添加到动物饲料中，改善动物的生长性能，减少疾病，提升动物免疫力上的应用。本专利技术通过构建酿酒酵母工程菌，在酿酒酵母中转入具有抑菌功能的猪防御素基因，使酿酒酵母也具有了抑菌功能，可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌和猪霍乱沙门菌等猪常见的病原菌，为酵母更好的在畜牧养殖业中发挥作用奠定了新的基础。附图说明图1:酵母重组载体pABD2a的构建过程。图2:pAUR123载体的酶切和猪防御素基因pBD2的扩增(1.8%琼脂糖凝胶)。1、Marker II ;2、lkb plus DNA ladder ;3、4 pAUR123/KpnI+SacI ;5、6pBD2 基因 PCR 扩增。图3:酵母重组载体pABD2插入的猪防御素基因的PCR鉴定电泳图谱(1.8%琼脂糖凝胶)。UMarker II ;2、3酵母重组质粒pABD2载体的PCR验证。图4:pPICZ a A 质粒的 a-factor 的扩增(1.8% 琼脂糖凝胶)。I> Marker II ;2、3a -factor 的 PCR 扩增。图5:酵母重组载体pABD2 α插入的a -factor基因的PCR鉴定电泳图谱(1.8%琼脂糖凝胶)。UMarker 11;2、阴性对照；3、4酵母重组载体pABD2a插入的a-factor的PCR验证。图6:酿酒酵母工 程菌YSBD58发酵上清对金黄色葡萄球菌的抑制作用。其中I为空白对照；2为酿酒酵母工程菌YSBD58发酵上清对金黄色葡萄球菌的抑制作用。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1酵母表达质粒pABD2的构建酵母表达质粒pABD2的构建过程如图1所示。根据猪防御素pBD2的序列设计上游引物pBD2-F:5’ -CTTGGTACCATGACTGGTTTGGGTC-3，和下游引物 pBD2-R_N_2:5 ’ -TTCGAGCTCTTATCTAATACAACACTTAGC-3’，在上游引物5’端引入酶切位点ΚρηΙ，在下游引物5 ‘端引入终止密码子TTA和酶切位点SacI。用英骏公司合成的猪防御素pBD2多肽基因为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为94°C预变性5分钟；94°C热变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30个循环；72°C延伸 3 分钟。PCR 体系为:引物 pBD2-F I μ L，pBD2-R_N_2 I μ L, IOXdNTP 2 μ L,IOXExTaq Buffer 2 μ L，ExTaq酶0.5 μ L，加超纯水补充体系到20 μ L。PCR扩增结果经1.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图2，PCR产物用PCR纯化试剂盒(天根公司)纯化，纯化步骤详见试剂盒说明书。纯化产物送测序公司测序，测序结果用DNAman软件比对正确。用KpnI和SacI酶切PCR纯化的产物，酶切体系为:PCR纯化产物20 μ L，IOXbuffer 25 μ L，KpnI和SacI各3 μ L，灭菌超纯水补充体系到250 μ L,酶切条件是37°C温育3小时。酿酒酵母表达载体pAUR123 (TaKaRa公司)的酶切体系是:PCR纯化产物25 μ L，IOXbuffer 25 μ L，KpnI和SacI各3 μ L，灭菌超纯水补充体系到250 μ L,酶切条件是37°C温育3小时。酶切产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图2。猪防御素pBD2多肽基因的酶切产物和pAUR123的酶切产物用PCR纯化回收试剂盒回收。回收后进行连接，连接体系是:pAUR123/KpnI和SacI 3 μ L，PCR酶切回收产物3yL,10XT4 DNA连接buffer I μ L，T4-DNA连接酶I μ L，加灭菌超纯水补充体系到10 μ L，4°C过夜连接。连接产物转化大肠杆菌热激感受态细胞JM109 (天根公司)。大肠杆菌热激转化的方法为:将100 μ L感受态细胞在冰上融化，加入IOyL连结产物，轻轻敲打混匀，冰上放置20分钟。42°C水浴热击90秒，取出置于冰上放置5分钟，力口Λ 900 μ L的LB培养基。37°C摇床150rpm震荡培养I小时后，取出200 μ L培养液涂布加Λ 20 μ g/mL Ap抗生素的平板，37°C过夜培养。挑取单菌落做菌落PCR，PCR体系和条件如上所述。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图3，PCR产物测序后，与预期片段的同源性达到100%。将构建的重组酵母猪防御素pBD2表达载体命名为pA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)工程菌，其是将猪防御素pBD2成熟肽的编码序列和酿酒酵母信号肽的编码序列克隆到酿酒酵母表达载体上，得到重组载体，将该重组载体转化入酿酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌,其是将猪防御素pBD2成熟肽的编码序列和酿酒酵母信号肽的编码序列克隆到酿酒酵母表达载体上，得到重组载体，将该重组载体转化入酿酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于:所述酿酒酵母为酿酒酵母YS58。3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于:所述酿酒酵母表达载体为PAUR123。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于:所述猪防御素PBD2成熟肽序列是指PBD2的26 69位氨基酸序列，所述酿酒酵母信号肽序列是指克隆自毕赤酵母表达质粒pPICZ a A的第941-1207位基因编码的89个氨基酸残基的酿酒酵母信号肽序列。5.根据权利要 求1 4任一项所述的酿酒酵母工程菌，其保藏编号为CGMCCN0.6921。6.一种构建权利要求1 5任一项所述的酿酒酵母工程菌的方法，将编码猪防御素PBD2成熟肽的DNA序列和编码酿酒酵母信号肽的DNA序列克隆入酵母表达载体pAUR123，得到具有抑菌功能的酿酒酵母工程菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭子欣，谢飞，冯秋月，吴雅琨，陈慧鑫，王安如，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京科高大北农饲料有限责任公司，浙江大北农农牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：