本发明专利技术公开了一种酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，先利用一步基因置换法将酿酒酵母菌株染色体上一条GLC3（糖原支链酶基因）等位基因替换成G418抗性基因，然后通过孢子分离方法得到只含有GLC3基因被替换的单倍体，从而得到GLC3基因突变了的纯合子。通过10L和500L发酵罐发酵验证，突变菌株生产腺苷蛋氨酸产量分别达到了7.93g/L和8.35g/L，比原始菌株提高了15.1%和24.7%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物技术、代谢工程领域，涉及一种通过代谢途径改造来提高酿酒 酵母菌株生产s-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。
技术介绍
S-腺苷-L-蛋氨酸，简称SAM，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中，是一种重要 的代谢中间产物。作为胞内甲基供体，SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中 扮演重要角色。同时，SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也 是一种非常有价值的医药分子，在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。 SAM在胞内是经过腺苷蛋氨酸合成酶催化，由蛋氨酸和三磷酸腺苷(ATP)结合生成 的。研究标明，胞质内过量的SAM对细胞毒害作用非常强，SAM不能在细胞液中大量贮存。然 而，酵母一类微生物却能在富含蛋氨酸的环境中大量合成并积累SAM，这是因为酵母细胞的 液泡中含有大量的带负电荷的聚磷酸盐，这些聚磷酸盐能固定住带正电荷的SAM。因此，酵 母成为了工业生产SAM的首选宿主。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性 强以及发酵条件容易控制等许多优良特性，因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生 产菌株。尽管天然的酿酒酵母生产腺苷蛋氨酸能力已经很强，但还是不能满足市场日益增 长的需求，寻求更多途径继续提高腺苷蛋氨酸的产量的任务迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是为满足腺苷蛋氨酸日益增长的工业生产需求，提供一种酿酒酵母 基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法。为此，针对工业中经常采用的双倍体菌 株，本专利技术采用以下技术方案： 酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法，其特征在于，对酿酒酵母菌 株糖原合成途径进行了敲除。 进一步地，所述对酿酒酵母菌株糖原合成途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染 色体上糖原支链酶基因 GLC3来实现的。 进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株，对所述酿酒酵母双倍体 菌株实施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒pUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到GLC3基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中， 通过G418平板筛选以及PCR验证，得到一条GLC3等位基因被置换的杂合子； 步骤3:将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生，收集孢子，溶解 孢子子囊壁后，分离孢子； 步骤4:将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成，挑取单菌落进行PCR 验证。 进一步地，所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株，对所述酿酒酵母单倍体 菌株实施所述敲除包括以下步骤： 步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物，以质粒PUG6为模版进行PCR，PCR产物经过纯 化得到GLC3基因的敲除框； 步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中， 通过G418平板筛选，挑取单菌落进行PCR验证。 进一步地，所述步骤1中设计含有GLC3基因同源臂的引物，该引物序列为： 上游引物GLC3-up: CCCTGATAACTTCCTGTTACTATTTAAGAACACCAAACCAAGTATAAAGACAGCTGAAGCTTCGTACGC, 下游引物GLC3_down: TATTGAGTCTTGATTTTCAGTAAGCAATATAGTATAGAGTTCATTCTTTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG。 进一步地，所述步骤2中通过G418平板筛选以及PCR验证，该PCR验证的引物序列 为： 上游引物 GLC3-A: 5 ' -CCCTGATAACTTCCTGTTAC-3 ' 下游引物GLC3-D: 5 ' -GAGTCTTGATTTTCAGTAAG-3 ' 进一步地，所述步骤3中溶解孢子子囊壁后，分离孢子，具体为:400微升孢子悬浮液中 加入10微升蜗牛酶溶液，37°C下水浴3h，然后用100w超声振荡处理5s，间歇7s，振荡5个周 期;显微镜下确认孢子充分分离。为实现上述目的，本专利技术所提供的提高酿酒酵母菌株生产s-腺苷-L-蛋氨酸的方 法，采用将GLC3基因敲除菌株进行发酵罐分批补料发酵生产SAM。进一步地，其发酵培养基成分具体为：10g/L葡萄糖，3g/L酵母粉，5g/L硫酸 铵，10g/L磷酸二氢钾，3g/L硫酸镁，0.1g/L七水硫酸锰，0.6 g/L七水硫酸锌， 0.55g/L硫酸亚铁，0.5g/L氯化钠，0.5g/L氯化|丐，1.6mg/L硫酸铜，4.84mg/L钼酸 铵，0.3mg/L生物素，3.6mg/L泛酸f丐，3.6mg/L微生物Bi, 3.6mg/L维生素 B6。 腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和ATP，添加外源蛋氨酸能快速加剧酿酒 酵母合成SAM，是最直接最有效率的提高SAM产量的方法。已有大量研究报道，过量表达腺苷 蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段。然而，通过代谢改造使ATP更多流入SAM合 成途径这一块的研究报道却很少。事实上，减少胞内ATP不必要的消耗，提高胞内ATP活性， 对提高酿酒酵母胞合成SAM效率也是十分重要的。 研究表明，酿酒酵母会在稳定期大量合成糖原，消耗碳源并且降低了胞内ATP活 性。而在SAM工业生产中却是在稳定期加入外源蛋氨酸，促使酿酒酵母来合成SAM;因此，糖 原合成途径对于工业生产SAM来讲是一条浪费资源的途径。而GLC3基因编码的糖原支链酶 GBE是糖原合成途径的关键酶，已经有报道指出，GLC3基因的突变缺失能直接导致宿主糖原 合成途径的缺失。因此，敲除GLC3这一个基因能达到敲除糖原合成途径，而糖原途径的去除 有望提高酿酒酵母的碳源利用率，提高胞内ATP的活性，进而促使SAM的合成与积累。 由于采用本专利技术的技术方案，本专利技术取得的优点和有益效果是:本专利技术能够适用 于各种酿酒酵母菌株。本专利技术从一个新角度对该菌株进行了代谢途径的改造，结果表明，糖 原途径缺失突变菌株的腺苷蛋氨酸产量达到了 7.93g/L，比原始菌株提高了 15.1%，从而可 以提高SAM的工业生产效率。另外，本专利技术采用了孢子分离技术来得到纯合的二倍体敲除菌 株，可以避免先单倍体分开敲除再融合的繁琐过程，提高了二倍体的敲除效率，且其为酿酒 酵母工业菌株，其本身具有的强腺苷蛋氨酸积累能力、优良的发酵特性以及食品安全的生 物性能，都是其它微生物不能比拟的，具有更好的技术效果。【附图说明】 图1为验证GLC3基因敲除过程的核酸凝胶电泳图。以GLC3-A和GLC3-D为引物，分别 对HD、HD-glc3杂合子、HD-glc3纯合子进行PCR验证。 图2为10L发酵过程中HD与HD-glc3的SAM产量对比图。SAM concentration即为SAM 浓度;Time为时间。底物蛋氨酸加入后开始计时，比较原始菌株HD与糖原合成途径缺失菌株 HD-glc3的SAM生产能力。【具体实施方式】 实施例1:以双倍体酿酒酵母菌株HD为例，构建GLC3基因敲除的杂合子。 1、PCR构建敲除框。方法如下：以质粒PUG6为模版，用引物对GLC3-UP和GLC3-down 进行P本文档来自技高网...
【技术保护点】
酿酒酵母基因工程改造提高S‑腺苷‑L‑蛋氨酸产量的方法，其特征在于，对酿酒酵母菌株糖原合成途径进行了敲除。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，赵伟军，杨修亮，杭宝建，黄磊，李江涛，蔡谨，
申请(专利权)人：山东金城生物药业有限公司，浙江大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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