本发明专利技术公开了一种热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过对K.variicola SHN-1普鲁兰酶的581位苯丙氨酸进行突变，得到了两个热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶突变体F581L和F581V，在55℃下的半衰期分别比野生型提高了4.20min、3.01min，Vmax值和kcat/Km值得到提高，表明本发明专利技术的突变体拥有更高的催化效率。本发明专利技术突变体热稳定性的提高使普鲁兰酶更适合工业应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶突变体，属于酶工程技术领 域。
技术介绍
普鲁兰酶是解支酶的一种，能水解的最小底物只需两条由α-1，6糖巧键连接的 含有两个由α-1,4糖巧键连接的葡萄糖链段。由于淀粉结构的复杂性，在淀粉解聚为低 聚糖或小分子单糖的过程中必须由多种酶协同作用。在淀粉糖化过程中，由于糖化酶对 α-1，6糖巧键的作用有限，因此目前双酶法生产淀粉糖制品的最高转化率只能达到96%。 如果在糖化过程中添加普鲁兰酶与糖化酶协同作用，则可将转化率提高到97%W上，并提 高生产效率，降低生产成本。 对普鲁兰酶的首次报道是在1943年，而普鲁兰酶的研究热潮始于1966年，Bender 和Wallenfels首次通过产气杆菌Klebsiellaaerogenes发酵获得普鲁兰酶。到目前为止， 已经从芽抱杆菌、产气气杆菌、放线菌，链球菌、链霉及一些嗜热菌中发现普鲁兰酶，不同来 源的普鲁兰酶，酶学性质也各有不同。由于糖化酶的作用条件具有高溫（55°C-65°C)和 弱酸性（pH4. 5-5. 5)的特点，所W大多数天然的普鲁兰酶的酶学性质限制了其在工业生 产中的应用。I型普鲁兰酶是糖巧水解酶13家族的成员之一，该家族成员的主要的催化部位 由四个结构域A、B、C、F构成。结构域A是由8个β-折叠、8个α-螺旋构成的中央催化 的（β/α)8折叠桶结构，该区域包含了催化Ξ联体（Asp,Asp,Glu)。较小的结构域Β插入 (0/α)8折叠桶的第Ξ个β-折叠和第Ξ个α-螺旋的中间，活性口袋正位于该结构域， 且（β/α)8折叠桶桶壁也由该结构域构成。由8个β-折叠形成希腊钥匙拓扑结构是结 构域C的特征性结构。而F结构域由一个小的a螺旋和6个β-折叠，折叠形成的βΞ明 治基序的β-反平行片层。结构域A的C端和Ν端分别连接着结构域C和结构域F。 W05]GH13家族的酶蛋白的氨基酸序列中几乎都含有四段高度保守的序列 巧egionl-IV)。所有I型普鲁兰酶几乎都含有一段保守序列ReginA灯NWGYD巧。运段序列 位于酶的中部，只与底物中的α-1,6糖巧键相结合。对来源于Κ.aerogenes的I型普鲁兰酶中的HiS-607、Asp-677、HiS-682 和 His-833进行突变后，His-607、Asp-677和His-833氨基酸改变后的酶蛋白活性完全丧失， 而化S-682的替换并不影响酶活性，对运些突变株进行α-或β-环糊精的结合亲和力分 析，发现化S-607,Asp-677的改变对普鲁兰酶与底物普鲁兰多糖的结合力产生负面影响， 但是化S-833的改变并没有对普鲁兰酶与底物的结合产生影响，表明化S-607,Asp-677是 与普鲁兰酶结合底物相关的位点，而His-833影响着普鲁兰酶的催化功能。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术利用定点突变获得耐热性和催化效率提高的普鲁兰酶 突变体。本专利技术采用全质粒PCR的方法对581位苯丙氨酸进行定点饱和突变，获得了热稳 定性和催化活性同时提高的突变酶F581L和巧81V，解决了普鲁兰酶的热稳定性不能满足 糖化反应条件的问题，为拓宽普鲁兰酶的工业应用奠定了基础。 本专利技术的目的是提供一种普鲁兰酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是 (1)沈QIDNO: 1或沈QIDNO: 2所示的序列； 似在严格条件下与（1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有普鲁兰酶活性的氨基 酸序列。 在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是对K.variicola来源的普鲁兰酶进行 氨基酸突变得到的。 在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将K.variicolaSHN-1来源的普鲁兰 酶（NCBI上GenBankaccessionno.JX087429)的第581位氨基酸突变成疏水性氨基酸。 在本专利技术的一种实施方式中，所述突变，是突变成鄉氨酸或亮氨酸。 在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体的核巧酸序列是SEQIDNO:3或SEQID NO:4所示的序列。 本专利技术还要求保护编码所述突变体的核巧酸片段、含有编码权利要求1所述突 变体的基因的载体、表达所述突变体的基因工程菌（尤其是大肠杆菌、酵母或枯草芽抱杆 菌），W及所述突变体在食品、化工或纺织领域的应用。 突变体命名方式： 采用"原始氨基酸位置替换的氨基酸"来表示突变体。如S234F，表示位置234的 氨基酸由亲本普鲁兰酶的Ser替换成化e，位置的编号对应于亲本普鲁兰酶的氨基酸序列。 本专利技术的有益效果： 本专利技术通过K.variicolaSHN-1普鲁兰酶化vPul)的地e581进行定点饱和突变， 获得热稳定性和催化活性同时提高的突变酶巧81L和巧81V。F581L和巧81V的最适溫度 由53°C提高到56°C，在55°C下的半衰期分别比野生型提高了 4. 20min、3.Olmin。同时，与野 生型相比，F581L和巧81V的VmJ直分别提高至2. 78倍、2. 85倍，k。。,/枯值提高至1. 6倍， 表明本专利技术的突变体拥有更高的催化效率。同时，本专利技术的突变体的最适抑没有变化，具 有更高热稳定性、更高催化效率、未改变最适抑的普鲁兰酶更适合糖化中应用。 普鲁兰酶测定方法： 阳02U 取100μL用lOOmM、pH5. 0的醋酸缓冲适当稀释的酶液与等体积的溶于lOOmM、 pH5.0醋酸缓冲中的lOg/L普鲁兰多糖相混合于50°C水浴中保溫30分钟。加入DNS试剂 300μL摇匀，置于沸水中煮沸15分钟，取出W流动水迅速冷却后，于540nm波长处，测定反 应液的吸光度值。 酶活单位定义：在上述指定的条件下，每分钟催化分解普鲁兰多糖生成相当于 1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶为1个酶活单位扣)。【具体实施方式】 实施例1:突变质粒构建 利用质粒提取试剂盒PlasmidMiniKit(购于OMEGABI0-T邸公司）从实验 室保藏的E.coliBL21(DE3)/pET-28a-kvpul(Wen-BoQien,Yao化e,YanXu.Si即al Peptide-Independent Secretory Expression曰nd Ch曰r曰cteriz曰tion of Pullul曰n曰se from a Newly Isolated Klebsiella variicola SHN-1 in Escherichia coli.Appl Biochem Biotechnol (2013) 169:41-54.)中提取质粒作为饱和定点突变的模板，所用的简 并引物序列为5' -3' GGC TAC GAT CCG NNK CAC TACACG GTG CC(序列如SEQ ID N0:5所 示）。 阳0巧]利用PrinKSTAR"服PCR酶（购于TaKaRa公司）采用全质粒PCR的方法对地e581 进行定点饱和突变。PCR反应体系为：10μ1SXPrimestarbuffe;r，4iildNTPmixture, 0.当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是：(1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列；(2)在严格条件下与(1)限定的氨基酸序列杂交且编码具有普鲁兰酶活性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂尧，徐岩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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