一种透明质酸酶的固定化方法技术

本发明专利技术公开了一种透明质酸酶的固定化方法，属于酶工程领域。本发明专利技术联合使用β‑环糊精、壳聚糖、TPP，对透明质酸酶进行包埋固定化，大幅度地提高了透明质酸酶的热稳定性，相比较于游离粗酶液在55℃下28min的半衰期，固定化酶在55℃下的半衰期提高到191min；并且固定化酶在重复使用11次后仍然保留了30％的初始酶活。本发明专利技术所得固定化透明质酸酶在工业化酶法生产透明质酸中有良好应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种透明质酸酶的固定化方法，属于酶工程领域。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得，广泛用于医药、化妆品、食品等领域。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。采用水蛭透明质酸酶催化降解HA，产生分子量范围均一的小分子透明质酸，具有反应条件温和、专一性高、且产品纯度高的特定。但如何降低透明质酸酶的消耗量、提高酶的使用寿命，成为进一步提高生产效率的途径。
技术实现思路
本专利技术提供了一种固定化透明质酸酶的方法，能够显著提高透明质酸酶的使用次数。所述方法，包括以下步骤：(1)向酶活为10000～15000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加β-环糊精，β-环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置0.5～1h；(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1～2h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为(3～4)：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为3～4％壳聚糖溶液；(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8～10％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(4)离心收集固定化酶的颗粒，经真空低温干燥即可获得固定化透明质酸酶。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)采用酶活为15000U/mL的透明质酸酶的酶液，β-环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置0.5h。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为4：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为4％壳聚糖溶液。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液。本方法联合使用β-环糊精、壳聚糖、TPP，对透明质酸酶进行包埋固定化，大幅度地提高了透明质酸酶的热稳定性，相比较于游离粗酶液在55℃下28min的半衰期，固定化酶在55℃下的半衰期提高到191min；并且固定化酶在重复使用11次后仍然保留了30％的初始酶活。本专利技术所得固定化透明质酸酶在工业化酶法生产透明质酸中有良好应用前景。具体实施方式酶活测定方法：反应体系为20mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制2mg/ml的HA，反应体系加入8mL的HA溶液、2mL的酶液，缓冲液补足至20mL；在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量，1U为一小时内水解产生1μg还原糖所需酶量。固定化酶活力的测定只需要将2mL的酶液用一定质量的固定化酶代替，其他步骤相同。固定化酶活收率计算公式如下：实施例1(1)向酶活为15000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加β-环糊精，β-环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置0.5h；(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为4：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为4％壳聚糖溶液；(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(4)离心收集固定化酶的颗粒，经真空低温干燥即可获得固定化透明质酸酶。实施例2(1)向酶活为14000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加β-环糊精，β-环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置1h；(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1.5h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为3.5：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为4％壳聚糖溶液；(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的10％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(4)离心收集固定化酶的颗粒，经真空低温干燥即可获得固定化透明质酸酶。对照例1(1)向酶活为15000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为4：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为4％壳聚糖溶液；(2)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(1)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(3)离心收集固定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化透明质酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向酶活为10000～15000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加β‑环糊精，β‑环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置0.5～1h；(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1～2h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为(3～4)：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为3～4％壳聚糖溶液；(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8～10％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(4)离心收集固定化酶的颗粒，经真空低温干燥即可获得固定化透明质酸酶。

【技术特征摘要】
1.一种固定化透明质酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向酶活为10000～15000U/mL的透明质酸酶的酶液中，添加β-环糊精，β-环糊精的添加量为透明质酸酶的酶液的质量的0.5％，搅拌均匀后，在室温下静置0.5～1h；(2)向步骤(1)所得溶液中添加壳聚糖溶液，搅拌均匀后，在室温下静置1～2h；壳聚糖溶液与透明质酸酶的酶液的质量比例为(3～4)：1，所述壳聚糖溶液是将粘度700cps、脱乙酰度95％以上的壳聚糖用体积浓度为0.05％的乙酸水溶液溶解，配成质量浓度为3～4％壳聚糖溶液；(3)将TPP水溶液在400r/min的搅拌速度下，以1mL/min的滴加速度加入到步骤(2)所得溶液中，形成固定化酶的分散体系；在4℃条件下静置1h；所述TPP的用量为壳聚糖质量的8～10％；所述TPP水溶液为质量浓度为5mg/mL的TPP水溶液；(4)离心收集固定化酶的颗粒，经真空低温干燥即可获得固定化透明质酸酶。2.根据权利要求1所述的一种固定化透明质酸酶的方法，其特征在于，步骤(1)采...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴银娣，
申请(专利权)人：吴银娣，
类型：发明
国别省市：江苏;32