一种高效重组表达透明质酸酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过在重组透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达，活性达到了21333.33U/mL。本发明专利技术所构建的重组毕赤酵母工程菌株，具有非常大的应用前景。本发明专利技术所提出的提高透明质酸酶高效表达制备的方法，进一步降低了透明质酸酶的生产成本，为工业化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体地是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列以显著提高透明质酸酶表达产量，属于基因工程
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技术介绍
透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)主要专一'丨生水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC 3.2.1.36)，通过水解HA的β_1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为 “药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。目前，水蛭来源的透明质酸酶基因尚未有相关报道。当前水蛭来源的透明质酸酶是以活体水蛭组织提取为主获得，且每个水蛭提取所获得透明质酸酶仅约为230U。本专利技术采用毕赤酵母重组生产透明质酸酶具有无法比拟的优势，突破了水蛭原料来源的限制和提取分离步骤的繁琐等因素的限制，能够推动透明质酸酶在医疗和科研上的广泛应用。外源蛋白在宿主中的活性表达与产量是构建工程菌最重要的两个指标，本专利技术在已获得水蛭透明质酸酶在毕赤酵母中活性分泌表达的基础上，通过人为在N端添加一段寡聚核苷酸序列，显著提高了透明质酸酶的表达产量。在N端添加的一段序列，对于mRNA的转录、稳定性和后翻译修饰，以及信号肽的后加工成熟分泌都有重要影响。而这些因素也显著影响着外源蛋白在宿主菌中的正确折叠、后加工修饰和顺利分泌。鉴于此，本专利技术中构建的新型重组工程菌显著提高了重组透明质酸酶的产量，该方法将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供，是在透明质酸酶基因N端添加一段寡聚核苷酸序列，构建透明质酸酶产量显著提高的基因工程菌。所述在透明质酸酶基因N端添加的一段寡聚核苷酸序列，其核苷酸序列如(a)或(b)所示:(a)如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；(b)与(a)中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；在其N端添加SEQ IDN0.1所述序列后所得重组透明质酸酶基因的序列如SEQ ID N0.3所示。具体地，是在透明质酸酶基因HaseA3887(SEQ ID N0.2)的N端添加一段核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GSl 15进行表达。包括以下步骤:基于透明质酸酶基因HaseA3887，合成引物时，在上游引物BYA3887HF引入限制性酶切位点EcoRI和18个核苷酸(6Xhis-tag序列)，下游引物BYA3887R引入NotI酶切位点；构建的重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887经SalI线性化后电转入P.pastoris GS115中并确认HaseA3887基因重组P.pastoris GS115成功。所述上游弓I 物 BYA3887HF: 5，-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGAC-3’ ；下游引物 BYA3887R:5’ -TCCGCGGCCGCTTATTTTTTGCACGCTTCAACGTTAGC-3’。本专利技术还提供了一种利用上述方法构建得到的重组毕赤酵母发酵生产透明质酸酶的方法,具体步骤如下:以含有重组透明质酸酶基因的重组毕赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-His-HaseA388 7为生产菌株，将种子培养液按10%的接种量接种到25mL(摇瓶容量250mL)BMGY培养基中，温度为30°C、pH为6.0培养至0D600为4，离心菌体接种到诱导表达培养基BMMY，每隔24h补加1%(ν/ν)甲醇，诱导表达96h。本专利技术方案中还包括一种特异性纯化重组表达的透明质酸酶的方法，重组透明质酸酶基因(SEQ ID N0.3)所编码的重组蛋白在N端形成6个连续的组氨酸标签，能与葡聚糖镍特异性结合。采用葡聚糖镍与发酵液混合孵育后，分别用0、10、20、30、40、50mM的咪唑洗脱杂质，再以500mM的咪唑缓冲液特异性洗脱目标蛋白，再进行梯度透析获得纯透明质酸酶蛋白。本专利技术方案在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列、构建了高效表达重组透明质酸基因的毕赤酵母菌，同时解决了透明质酸酶基因高效表达及透明质酸酶亲和纯化的问题。所得重组毕赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵上清酶活是对照重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K_HaseA3887发酵上清酶活的5倍以上；所得酶通过特异性亲和纯化即可得到。本专利技术通过在透明质酸基因上游添加一段核苷酸序列。本专利技术将有利于进一步降低工业化生产水蛭透明质酸酶的成本，更有利于水蛭透明质酸酶的医疗药用和科研范围的扩大，在工业上具有巨大的应用价值。【附图说明】图1所示为平板法检测发酵上清液透明质酸酶的活性(1，A3887HF重组透明质酸酶发酵上清液水解HA反应产生透明圈；2，pPIC9k-GS115对照发酵上清液作对照)。图2所示为摇瓶发酵产透明质酸酶的粗酶液酶活力山对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA3887 ;2，本专利技术重组菌株 GS115/pPIC9K-His_HaseA3887。图3所示为重组透明质酸酶的蛋白SDS-PAGE电泳结果(M，蛋白marker ;1，GS115/pPIC9k菌株发酵液上清；2，对照重组菌株GS115/pPIC9K-HaseA388发酵液上清；3，重组GS115/pPIC9K-His-HaseA3887发酵液上清；4，NTA-Ni纯化的重组透明质酸酶蛋白)。【具体实施方式】材料与方法:透明质酸酶活力单位定义:在ρΗ5.5和38°C下，每小时从透明质酸中释放I μ g葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。平板透明圈法检测透明质酸酶活性:透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。DNS还原糖测定方法:水蛭透明质酸酶水解HA，通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如下(a)或(b)所示的序列：(a)SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，(b)与(a)中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。

【技术特征摘要】
2013.08.15 CN 201310358573.71.一种高效重组表达透明质酸酶的方法，是在透明质酸酶基因N端添加一段核苷酸，构建基因工程菌进行表达；所述添加的核苷酸序列为如下(a)或(b)所示的序列: (a)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列, (b)与(a)中的序列具有类似功能，添加至透明质酸酶基因N端不引起翻译移码，能活性表达透明质酸酶并提高重组透明质酸酶表达量和/或酶活。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是在SEQID N0.2所示的透明质酸酶基因的N端添加一段SEQ ID N0.1所示的核苷酸，构建重组质粒pPIC9K-His-HaseA3887，转化毕赤酵母P.pastoris GS115进行表达。3.根据权利要求1所述方法获得的重组载体。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，康振，金鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：