重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法技术

本发明专利技术涉及用生物医药领域，尤其涉及重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法。本发明专利技术的一个目的是提供一种重组人透明质酸酶及其制备方法，该方法将人透明质酸酶基因整合入毕赤酵母工程菌中，通过发酵纯化，得到大量高活性高纯度的重组人透明质酸酶。本发明专利技术的二个目的是提供一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物及其制备方法，该化合物活性高、免疫原性低、稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用生物医药领域，尤其涉及重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚 乙二醇共价修饰的化合物和方法。
技术介绍
透明质酸酶（hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核 和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、 生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生， 是一种重要的生理活性物质。且于1928年被DuranReynals首次发现并称为"扩散因子"， 1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。 其作用机理是通过催化透明质酸的水解，从而降低透明质酸的黏度，由此提高组 织通透性，因此其作为一种重要的药物扩散剂，在临床上被广泛应用；除此之外，在美容领 域也有广泛的应用，如整形修复，低分子量透明质酸生产等。目前国内透明质酸酶基本来源是动物组织提取获得，存在纯度低（1-5% )、免疫 原性强、易产生过敏反应等问题。目前国外已有各种形式的透明质酸酶被制备和批准用于人的治疗用途。例如，源 于动物的透明质酸酶制备品包括纯化的羊睾丸透明质酸酶Vitrase?(ISTAPharmaceutical s)和牛睾丸透明质酸酶Amphadase?(AmphastarPharmaceuticals)。Hylenex?(Halozy meTherapeutics)是人重组透明质酸酶，其通过经遗传工程修改的中国仓鼠卵巢（CH0)细 胞产生，所述CH0细胞含有编码可溶性rHuPH20的核酸。经FDA批准的对于透明质酸酶的 治疗用途包括作为佐剂使用以提高用于皮下注入（皮下液体施用）的其它所注射的药物的 吸收和分散，以及在皮下尿路造影术（subcutaneousurography)中作为助剂用以改善放射 造影剂（radiopaqueagent)的再吸收。在这些适应症之外，透明质酸酶包括sHuPH20,可作 为治疗或美容药剂用于处理另外的疾病和状况。 在专利CN103614352A中，专利技术人公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，通 过在水蛭的透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，构建重组毕赤酵母工 程菌株，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表 达。 在专利CN104263707A中，专利技术人公开了一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶 的方法，通过在水蛭的透明质酸酶基因前段融合一段信号肽序列，解决了原重组菌株产量 较低的问题，实现了重组透明质酸酶在毕赤酵母中产量的显著提高，为进一步降低水蛭透 明质酸酶的生产成本和扩大应用范围奠定了一定的基础，适合于工业化生产。 在专利CN101970650A中，专利技术人公开了一种可溶性透明质酸酶的大规模生产方 法，将人的透明质酸酶基因通过基因工程手段加入中国仓鼠卵巢（CH0)细胞中，所述CH0细 胞含有编码可溶性rHuPH20的核酸，通过宿主细胞（CHO)培养发酵，得到可溶性透明质酸 酶。 透明质酸酶的稳定性较差，其在机体内的主要不良反应是产生免疫反应，引起过 敏反应。静脉注射血浆半衰期短，动物药代动力学研宄表明该酶进入体内半衰期（T1/2)小 于3分钟。聚乙二醇（polyethyleneglycol)，简称PEG)修饰技术的应用使PEG的许多优 良特性转移到修饰的透明质酸酶中去。当PEG偶联到透明质酸酶分子表面时，透明质酸酶 的稳定性大大增强，同时可减少透明质酸酶药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并 使透明质酸酶药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG修饰的透明质酸酶药代动力学性质也 发生很大的改变，半衰期延大大长。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组人透明质酸酶及其制备方法，该方法将人透明 质酸酶基因整合入毕赤酵母工程菌中，通过发酵纯化，得到大量高活性高纯度的重组人透 明质酸酶。本专利技术的二个目的是提供一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物及其制备 方法，该化合物活性高、免疫原性低、稳定性好。 为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： 一种重组人透明质酸酶的制备方法，该方法包括以下的步骤： 1)表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌： 将人透明质酸酶基因片段插入到表达载体的酶切位点上，转化至E.coilT0P10 中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，重组质粒经SacI线性化后电转入表 达宿主毕赤酵母中（P.pastoris)，得到工程菌，其中所述的表达载体是pPIC系列载体； 2)阳性克隆的筛选、培养、诱导表达： 筛选出阳性克隆在培养基中进行培养，经诱导使目标蛋白表达； 3)表达产物的分离纯化： 收集发酵液，经离心得到发酵上清，然后对发酵上清用层析技术纯化； 上述的人透明质酸酶的cDNA序列如SEQIDN0:1所示，编码一个序列如SEQID N0:2所示氨基酸的蛋白质；所述的人透明质酸酶的编码序列来源于基因文库，或者根据文 献报道的人透明质酸酶的cDNA序列全基因合成，或者设计引物，通过PCR扩增获得。 作为优选，所述的pPIC系列载体是pPIC9k、pPICZaA、pPICZaB、pPICZaC中的 一种或多种。 作为优选，所述的步骤1)中表达载体的酶切位点是XhoI/XbaI或BamHI/NotI 位点。 作为优选，所述的步骤2)中阳性克隆筛选采用Zeocin做抗性筛选。 作为优选，所述的步骤2)中的培养温度控制在25-40°C，再优选的培养温度控制 在 30-35 °C。 作为优选，所述的步骤2)中的诱导表达使用终浓度0. 5% -1. 5% (v/v)的甲醇作 为诱导剂，再优选的诱导表达使用终浓度0.5%-1% (v/v)的甲醇。 作为优选，所述的步骤2)的诱导表达温度控制在25-40°C，再优选的诱导表达温 度控制在30-35 °C。 作为优选，所述的步骤3)中的层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析 中的一种或多种方法。 本专利技术还公开了上述任一项技术方案获得重组人透明质酸酶。 为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： 上述的重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物；聚乙二醇和重组人透明质酸酶以 共价键连接，每个重组人透明质酸酶分子平均结合5~15个聚乙二醇分子，聚乙二醇修饰 重组人透明质酸酶的酶比活性大于25, 000U/mg。作为优选，酶比活性为大于30, 000U/mg。 作为优选，所述的聚乙二醇为含单一活性功能基团的直链单甲氧基聚乙二醇，其 结构式如下：【主权项】1. 一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤： 1) 表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌： 将人透明质酸酶基因片段插入到表达载体的酶切位点上，转化至E. coil TOPlO中，在 确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，重组质粒经Sac I线性化后电转入当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1)表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌：将人透明质酸酶基因片段插入到表达载体的酶切位点上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，重组质粒经Sac I线性化后电转入表达宿主毕赤酵母中(P.pastoris)，得到工程菌，其中所述的表达载体是pPIC系列载体；2)阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基中进行培养，经诱导使目标蛋白表达；3)表达产物的分离纯化：收集发酵液，经离心得到发酵上清，然后对发酵上清用层析技术纯化；上述的人透明质酸酶的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码一个序列如SEQ ID NO:2所示氨基酸的蛋白质；所述的人透明质酸酶的编码序列来源于基因文库，或者根据文献报道的人透明质酸酶的cDNA序列全基因合成，或者设计引物，通过PCR扩增获得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翔，张加慧，封小燕，刘沐荣，
申请(专利权)人：杭州北斗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33