用于RNA定向的靶DNA修饰和用于RNA定向的转录调节的方法和组合物技术

本公开提供包含靶向序列的靶向DNA的RNA，以及修饰多肽，提供靶DNA和/或与所述靶DNA相关的多肽的位点特异性修饰。本公开进一步提供位点特异性修饰多肽。本公开进一步提供位点特异性修饰靶DNA和/或与所述靶DNA相关的多肽的方法。本公开提供调节靶细胞中的靶核酸转录的方法，所述方法总体上涉及使所述靶核酸与酶失活的Cas9多肽和靶向DNA的RNA接触。还提供执行所述方法的试剂盒和组合物。本公开提供产生Cas9的遗传修饰的细胞；和Cas9转基因非人多细胞生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于RNA定向的靶DNA修饰和用于RNA定向的转录调节的方法和组合物交叉引用本申请要求2012年5月25日提交的美国临时专利申请号61/652,086、2012年10月19日提交的美国临时专利申请号61/716,256、2013年1月28日提交的美国临时专利申请号61/757,640以及2013年2月15日提交的美国临时专利申请号61/765,576的权益，所述申请各自均以引用的方式整体并入本文。关于联邦资助的研究的声明本专利技术根据国家卫生研究所授予的授权号GM081879下的政府资助产生。政府对本专利技术具有一定权利。以引用的方式并入呈文本文件提供的序列表特此提供呈2013年3月13日创建的文本文件“BERK-187WO-SeqList_ST25.txt”的序列表并且其具有7645KB的大小。文本文件的内容以引用的方式整体并入本文。背景大约60％的细菌和90％的古细菌具有CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)/CRISPR相关的(Cas)体系系统以赋予对外来DNA元件的抗性。来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的II型CRISPR系统仅涉及编码Cas9蛋白的单个基因和两个RNA(成熟CRISPRRNA(crRNA)和部分互补的反式作用RNA(tracrRNA))，所述单个基因和两个RNA为RNA引导沉默外来DNA所必要和充分的。近年来，被设计靶向特异性DNA序列的工程化的核酸酶作为用于遗传操纵细胞和整个生物、允许靶向的基因缺失、替换和修复以及将外源序列(转基因)插入到基因组中的有力工具而吸引了相当多的注意。已出现用于工程化位点特异性DNA核酸酶的两大技术，所述两大技术均基于构建嵌合的核酸内切酶，其中序列非特异性DNA核酸内切酶结构域融合至工程化的DNA结合结构域。然而，靶向每个新基因组基因座需要设计新型核酸酶，从而使得这些方法既耗时又昂贵。另外，这两种技术均遭受有限的精确度，这可导致不可预测的脱靶效应。基因组的系统询问和细胞的遗传重新编程涉及靶向用于表达或阻抑的基因集合。目前，用于靶向调节用的任意基因的最常见方法为使用RNA干扰(RNAi)。此方法具有局限性。例如，RNAi可表现出显著的脱靶效应和毒性。在本领域中存在对允许以不需要设计用于每个新靶序列的新蛋白质的方式将核酸酶活性(或其它蛋白质活性)精确靶向至靶DNA内的相异位置的技术的需要。另外，本领域中存在对控制具有极小脱靶效应的基因表达的方法的需要。概述本公开提供包含靶向序列的靶向DNA的RNA，以及修饰多肽，提供靶DNA和/或与靶DNA相关的多肽的位点特异性修饰。本公开进一步提供位点特异性修饰多肽。本公开进一步提供位点特异性修饰靶DNA和/或与靶DNA相关的多肽的方法。本公开提供调节靶细胞中的靶核酸转录的方法，所述方法总体上涉及使靶核酸与酶失活的Cas9多肽和靶向DNA的RNA接触。还提供执行方法的试剂盒和组合物。本公开提供产生Cas9的遗传修饰的细胞；和Cas9转基因非人多细胞生物。特征本公开的特征包括靶向DNA的RNA，其包含：(i)第一区段，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(ii)第二区段，其与定点修饰多肽相互作用。在一些情况下，第一区段包含8个与靶DNA中的序列具有100％互补性的核苷酸。在一些情况下，第二区段包含在一段至少8个连续核苷酸(stretch)上与SEQIDNO:431-682(例如，431-562)中列出的任一核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列。在一些情况下，第二区段包含在一段至少8个连续核苷酸上与SEQIDNO:563-682中列出的任一核苷酸序列具有至少60％同一性的核苷酸序列。在一些情况下，定点修饰多肽包含与图3中描绘的Cas9/Csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003或与在如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应部分具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。本公开的特征包括DNA多核苷酸，其包含编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列。在一些情况下，重组表达载体包含DNA多核苷酸。在一些情况下，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列可操作地连接至启动子。在一些情况下，启动子为诱导型启动子。在一些情况下，编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列还包含多克隆位点。本公开的特征包括体外遗传修饰的宿主细胞，其包含DNA多核苷酸。本公开的特征包括重组表达载体，其包含：(i)编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中靶向DNA的RNA包含：(a)第一区段，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(b)第二区段，其与定点修饰多肽相互作用；以及(ii)编码定点修饰多肽的核苷酸序列，所述定点修饰多肽包含：(a)与靶向DNA的RNA相互作用的RNA结合部分；以及(b)表现出定点酶活性的活性部分，其中酶活性的位点通过靶向DNA的RNA来确定。本公开的特征包括重组表达载体，其包含：(i)编码靶向DNA的RNA的核苷酸序列，其中靶向DNA的RNA包含：(a)第一区段，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(b)第二区段，其与定点修饰多肽相互作用；以及(ii)编码定点修饰多肽的核苷酸序列，其中定点修饰多肽包含：(a)与靶向DNA的RNA相互作用的RNA结合部分；以及(b)调节靶DNA内的转录的活性部分，其中靶DNA内的所调节的转录的位点通过靶向DNA的RNA来确定。本公开的特征包括变体定点修饰多肽，其包含：(i)与靶向DNA的RNA相互作用的RNA结合部分，其中靶向DNA的RNA包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(ii)表现出减小的定点酶活性的活性部分，其中酶活性的位点通过靶向DNA的RNA来确定。在一些情况下，变体定点修饰多肽包含酿脓链球菌序列SEQIDNO:8的H840A突变或如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应突变。在一些情况下，变体定点修饰多肽包含酿脓链球菌序列SEQIDNO:8的D10A突变或如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应突变。在一些情况下，变体定点修饰多肽包含(i)酿脓链球菌序列SEQIDNO:8的D10A突变或如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应突变；以及(ii)酿脓链球菌序列SEQIDNO:8的H840A突变或如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应突变。本公开的特征包括嵌合定点修饰多肽，其包含：(i)与靶向DNA的RNA相互作用的RNA结合部分，其中靶向DNA的RNA包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(ii)表现出定点酶活性的活性部分，其中酶活性的位点通过靶向DNA的RNA来确定。在一些情况下，嵌合定点修饰多肽包含与图3中描绘的Cas9/Csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003或与在如SEQIDNO:1-256和795-1346所列出的任何氨基酸序列中的对应部分具有至少约75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，靶向DNA的RNA还包含在一段至少8个连续核苷酸上与SEQIDNO:431-682(例如，SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向DNA的RNA，其包含：(i)第一区段，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；以及(ii)第二区段，其与定点修饰多肽相互作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.25 US 61/652,086;2012.10.19 US 61/716,256;1.一种修饰靶DNA的方法，所述方法包括使所述靶DNA与复合物接触，所述复合物包含：(a)Cas9多肽，以及(b)单分子靶向DNA的RNA，其包含：(i)DNA靶向区段，其包含与所述靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)蛋白质结合区段，其与所述Cas9多肽相互作用，其中所述蛋白质结合区段包含杂交以形成双链RNA(dsRNA)双链体的两个互补核苷酸段，其中所述dsRNA双链体包含tracrRNA和CRISPRRNA（crRNA）的互补核苷酸，其中所述两个互补核苷酸段是通过插入核苷酸共价连接，其中所述接触为体外的或在离体细胞内；以及其中所述修饰为裂解所述靶DNA。2.如权利要求1所述的方法，其中所述dsRNA双链体的长度为8个碱基对(bp)至30bp。3.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。4.如权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA存在于细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物、植物细胞、无脊椎动物细胞或脊椎动物细胞中。6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶DNA为染色体DNA。7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a)所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b)所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。8.如权利要求5所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a)所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b)所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。9.如权利要求6所述的方法，其中所述接触包括将以下引入细胞：(a)所述Cas9多肽或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，和(b)所述靶向DNA的RNA或编码所述靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸。10.如权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。11.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。12.如权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括将供体多核苷酸引入到所述细胞中。13.如权利要求1-4和8-12中任一项所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。14.如权利要求5所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。15.如权利要求6所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。16.如权利要求7所述的方法，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。17.如权利要求1-4和8-12中任一项所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。18.如权利要求5所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。19.如权利要求6所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。20.如权利要求7所述的方法，其中将蛋白质转导结构域连接至所述Cas9多肽的羧基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。21.一种组合物，其包含：(a)Cas9多肽，或编码所述Cas9多肽的多核苷酸，以及(b)单分子靶向DNA的RNA，或编码所述单分子靶向DNA的RNA的DNA多核苷酸，其中所述单分子靶向DNA的RNA包含：(i)DNA靶向区段，其包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列；和(ii)蛋白质结合区段，其与所述Cas9多肽相互作用，其中所述蛋白质结合区段包含杂交以形成双链RNA(dsRNA)双链体的两个互补核苷酸段，其中所述dsRNA双链体包含tracrRNA和CRISPRRNA(crRNA)的互补核苷酸，和其中所述两个互补核苷酸段是通过插入核苷酸共价连接。22.如权利要求21所述的组合物，其中所述dsRNA双链体的长度为8个碱基对(bp)至30bp。23.如权利要求21所述的组合物，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。24.如权利要求22所述的组合物，其中所述蛋白质结合区段的杂交以形成dsRNA双链体的核苷酸之间的互补百分比为70%以上。25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述靶DNA存在于细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物、植物细胞、无脊椎动物细胞或脊椎动物细胞中。26.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中所述靶DNA为染色体DNA。27.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。28.如权利要求25所述的组合物，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9多肽的氨基末端，其中所述蛋白质转导结构域促进所述Cas9多肽从胞质横穿到细胞的细胞器中。29.如权利要求26所述的组合物，其中将蛋白质转导结构域共价连接至所述Cas9...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·多德纳，M·金内克，K·凯林斯基，埃玛纽埃尔·沙尔庞捷，J·H·多德纳凯特，W·利姆，亓磊，
申请(专利权)人：埃玛纽埃尔·沙尔庞捷，加利福尼亚大学董事会，维也纳大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE