用于对修饰的肽进行定量的方法技术

本发明专利技术提供定量样品中修饰肽的方法，包括：(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)获得的肽中，产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MS)以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库：(i)从样品中获得肽；(ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；(iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；(iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，鉴定所述修饰肽；和(v)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及，尤其是涉及用于对磷酸化的肽进行定量的方法。此类方法用于例如鉴定和定量蛋白上的磷酸化位点，以及用于定量蛋白激酶的活性。多数蛋白通过添加官能团而以一定方式被修饰，这些修饰可以通过质谱法来检测。可以通过质谱法检测的蛋白修饰包括磷酸化、硝化、糖基化、乙酰化、甲基化和脂化。这些蛋白修饰在细胞中具有多种生物学功能。质谱法(MS)是分析技术，其测定当分子或原子被离子化、蒸气化并被导入能够根据它们的质荷比分离这些离子的仪器时，所形成的离子的质荷比(m/z)。质谱法还包括将分子分解为片段，因此能够测定分子的结构。MS与液相色谱法的物理分离技术的组合被称作液相色谱-质谱法(LC-MS)。在典型的MS程序中，样品被载入MS仪器，存在于该样品中的化合物被离子化，例如，通过电喷射离子化(ESI)或基质辅助激光解吸/离子化(MALDI)。然后，通过不同形式的质量分析器，例如飞行时间、离子捕获或四极或这些的组合，来计算离子的质荷比。正常细胞的动态平衡由信号传导途径的作用控制，当所述作用被下调时，也引起很多疾病，包括癌症、神经退化、过敏和糖尿病。蛋白和脂激酶是这些途径的主要成员，因此，这些酶代表用于治疗很多疾病的药物靶的最重要的类别之一。已经报道了用于无偏(unbiased)检测酶活性的方法。可以使用化学探针来共价连接酶活性位点中的有反应活性的氨基酸(Blethrow，J. D.等人，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)105，1442-1447Q008))或底物上的有反应活性的氨基酸 (Barglow,K. Τ. &Cravatt,B. F. Nat Methods (自然方法)4，822-827 Q007))。将连接于探针的蛋白亲和纯化并通过质谱法测定它们的性质。该方法可以检测活性和底物，但是其需要大量的细胞，并且所提供的信息仅为定性的。作为更加定量化的方法，已知为特定激酶的底物的蛋白上的磷酸化位点的定量是激酶活性的度量。当使用质谱作为读出来执行时，该方法允许在单一实验中定量数百至数千个磷酸化位点。例如，使用以稳定同位素进行的代谢标记(SILAC方法)，可以定量以EGF 处理HeLa细胞之后显示出改变的表达水平的大于2000个磷酸化位点(Olsen，J. V.等人， Cell (细胞)127,635-648 (2006))。然而，由于细胞需要保持代谢活性以引入标记的氨基酸，所以该方法不能用作一般性工具来定量原代组织中的信号传导，并且其低通量限制了其有用性。使用同位素标记的内部标准肽来测定磷酸化的肽可以是替代方式(Gerber， S. Α.等人，Proc Nat/Acad Sci U S A (美国国家科学院学报)100，6940-6945 (2003))，但是，虽然在理论上是可能的，但是在实际中不可能合成数以千计的以稳定同位素标记的磷酸化的肽以用作内部标准。iTRAQ试剂可用于以稳定同位素化学地标记肽(Ross，P.L.；等人，Mol Cell Proteomics (分子和细胞蛋白质组学)2004，3，(12)，1154-69.)。该技术可用于肽、包括修饰肽的相对定量。其局限性在于可以被比较的样品数受到同位素标记物数目的限制，对于获得数据的统计学验证，这对其有用性增加了限制。在临床环境中，化学标记也是不实际的，可能在化学反应步骤弓I入差异性。因此，本领域需要可用于无偏、全面且精确地测定原代组织中的信号传导的方法。本专利技术人专利技术了改进的用于定量修饰的肽尤其是磷酸化的肽的方法。该方法包括产生修饰的肽的数据库和将该数据库与获自生物样品的数据进行比较，通常使用计算机程序进行。在第一方面，本专利技术提供了用于定量样品中的修饰肽的方法，该方法包括(a)从样品中获得肽；(b)将参考修饰肽添加到步骤(a)中获得的肽中，以产生肽与参考修饰肽的混合物；(c)在所述肽与参考修饰肽的混合物上进行质谱(MQ以获得与样品中的肽相关的数据；和(d)使用计算机程序将与样品中的肽相关的数据与修饰肽的数据库中的数据进行比较；其中通过以下方法编撰所述修饰肽的数据库i)从样品中获得肽；ii)从获自步骤(i)的肽富集修饰肽；iii)在获自步骤(ii)的富集的修饰肽上进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；iv)将步骤(iii)中检测的修饰肽与已知的参考数据库进行比较，以鉴定所述修饰肽；和ν)将与步骤(iv)中鉴定的修饰肽相关的数据编撰成数据库。本专利技术提供了用于定量样品中的修饰肽的方法。本专利技术的方法适合于定量含有可通过质谱检测的任何修饰的肽。本专利技术的方法用于定量源自较长的蛋白的修饰肽。本专利技术的方法可用于同时定量数以千计的修饰肽。本专利技术的方法特别适合于定量样品中的磷酸化的肽，因此，在一个实施方式中，所述修饰肽是磷酸化的肽。在本专利技术的该实施方式中，术语“磷蛋白(phosphoprotein) ”本文中用于指磷酸化的蛋白，术语“磷酸肽(phosphop印tide) ”在本文中用于指磷酸化的肽。本专利技术的方法还用于定量通过例如乙酰化、硝化、糖基化、甲基化和/或脂化修饰的肽。本专利技术的方法用于定量任意含有肽的样品中的修饰肽。所述样品通常是生物样品，因此可以是获自生物来源的任何类型的样品，例如，获自人、动物、植物或细菌的样品。 因此，本专利技术包括使用获自人和非人来源的样品。本专利技术的方法用于检测和定量来自任何目标物种的样品的修饰肽。通常而言，本专利技术的方法用于分析来自人或动物的样品。所述动物通常是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、 豚鼠、母牛、绵羊或山羊。所述动物备选为鸟类例如鸡，鱼类例如斑马鱼，线虫类例如蠕虫，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，或昆虫例如果蝇，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。本专利技术的方法也可用于分析来自其它生命形式例如细菌和酵母的样品。本专利技术的方法可用于分析来自在实验上具有重要意义的细菌物种的样品，所述细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或酵母，例如面包酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母，粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。本专利技术的方法也可用于分析来自植物或真菌或病毒的样PΡΠ O通常而言，生物样品源自人，并且可以是例如体液样品，例如尿或血液，或其它组织。通常而言，生物样品是细胞系或组织，通常是原代组织。例如，样品可以是来自人或动物的组织。人或动物可以是健康的或患病的。在本专利技术的一些实施方式中，在进行本专利技术的方法之前，以测试底物处理样品本身或该样品所获自的生物。因此，在该实施方式中，在细胞系或组织上进行本专利技术的方法之前，以测试底物处理细胞系或组织所获自的生物。所述测试底物通常是外源化学品或药物， 例如小分子抑制剂、RNAi、治疗肽和抗体。本专利技术的该实施方式允许研究测试底物对于肽修饰的效应。例如，在一个实施方式中，当本专利技术的方法用于定量磷酸化的肽时，可以在实施本专利技术的方法之前，以途径激动剂和/或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴特·万哈瑟布勒克，佩德罗·罗德里格斯库蒂利亚斯，
申请(专利权)人：玛丽女王和威斯菲尔德学院，
类型：发明
国别省市：