本公开内容涉及从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中鉴别和分离山梨醇脱氢酶启动子的方法。另外，本公开内容还涉及在巴斯德毕赤酵母中受山梨醇脱氢酶启动子控制的异源蛋白的表达。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术描述了来自己斯德毕赤酵母（P.pastoris)的山梨醇脱氨酶启动子的鉴别 和分离，W及在所述分离的启动子的影响下，己斯德毕赤酵母中异源蛋白质的表达，具体地 人白蛋白（HA)和刺桐膜蛋白酶抑制剂巧TI)的表达。
技术介绍
己斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)是广泛使用并且公认的用于生产治疗性重组 蛋白的工业宿主。治疗性重组蛋白的生产具有几个问题，如N末端（Pr油ha等人，2009)或 C末端的剪切，所需糖型（glyco化rm)的引入（WouterVervecken等人，2004)。需要提高蛋 白产率和质量W满足不断增长的市场需求W及对生物相似性不断增加的调控问题。该可W 通过共表达分子侣伴蛋白（Wei化ang等人，2006)、共表达蛋白酶W获得所需的最终产物来 实现。在所有该些情况下，需要额外的启动子来进行遗传操作W改善重组蛋白的品质和数 量。[000引 美国专利No. 6033898公开了分离自酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)山梨 醇脱氨酶基因的DM部分，其用于提高异源多肤的产生。美国专利No. 5139936公开了含有 外源基因W及在适当位置上的酵母半乳糖巧酶（GAL1)调控区和启动子的克隆载体W提高 外源基因的表达。美国专利No. 5089398公开了使用来自甘油醒-3-磯酸脱氨酶的启动子 区域控制酵母中外源多肤的表达。 尽管对于毕赤酵母表达系统有几种组成型或诱导型启动子可用，但是在大部 分研究和应用中使用了A0X1。A0X1启动子是强诱导型启动子并且受碳源严格控制， 当在存在除甲醇外的大部分其它碳源的情况下生长己斯德毕赤酵母时，表达被高度抑 审IJ。甲醇是A0X1启动子的诱导剂（imlucer)，由于其高可燃性和毒性，甲醇是危险物品， 另外，依靠甲醇生长的细胞具有很高的氧消耗，其通常需要加入纯氧进行培养，因此提 高了工艺成本并且限制了大规模培养能力（MonikaBollok等人，RecentPatentson biotechnology, 3(2009) 192-201)。 另外，从依靠甲醇生长的己斯德毕赤酵母释放的宿主细胞蛋白质化(P)很高，其 主要在细胞溶解期间获得，但是当用葡萄糖作为碳源生长时，其程度要低得多。因此，细胞 维持更高的存活力和更高纯度的分泌蛋白。 此外，酿酒酵母（S.cerevisiae)中鉴别的山梨醇脱氨酶启动子为75化P。由于较 大的碱基对大小，它不易于进行遗传操作，因为它将导致载体大小的增加。本专利技术旨在克服 上述问题。另外，在本领域中需要鉴别更多在己斯德毕赤酵母中用于异源重组蛋白表达而 不需要用于蛋白表达的任何特异性诱导的启动子。
技术实现思路
因此，本专利技术设及SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列；分离SEQIDNo. 1的方法，所 述方法包括W下行为（act) ;a)从己斯德毕赤酵母分离基因组DNA，b)扩增在分离的基因组 DM内包含SEQIDNo. 1的区域，和c)对扩增产物进行常规凝胶洗脱程序（conventional gelelutionproce化re)W分离所述SEQIDNo. 1;在包含非特异性诱导剂的培养基 (media)中在SEQIDNo. 1的调控（调节，regulation)下表达基因的方法，所述方法包括 W下行为；a)在SEQIDNo. 1下游的表达构建体（expressionconstruct)中克隆所述基 因，b)用所述表达构建体转化宿主，和C)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQID No. 1的调控下表达所述基因W产生异源蛋白；包含如上所述的核巧酸序列的载体；包含如 上所述载体的转化的宿主细胞。【附图说明】[000引图1显示了SDPHA/PMBL208的限制性酶切分析。所有消化产生了预期图谱。 图 2 显示了SDPHA/pMBL208 的载体图。 图3显示了在G418抗生素上选择高重组蛋白产生菌（prcxlucer)的集落筛选。箭 头所示的集落表示较高抗性的克隆。 图4显示了己斯德毕赤酵母基因组中整合基因的PCR确认。发现所有所选的克隆 具有所关注的基因。[001引图5显示当使用山梨糖醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。[001引图6显示当使用甲醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。 图7显示当使用葡萄糖作为唯一碳源生长时HA的表达分析。 图8显示没有任何诱导的不含细胞的上清液的表达分析（细胞在扩增培养基中生 长）。 图9显示了ETI表达构建体的图片；A)在山梨醇脱氨酶启动子的控制下，在化〇1 和E.coRI限制酶切位点中克隆ETI。B)上游无启动子的ETI。 图10显示当使用山梨糖醇作为唯一碳源生长时ETI的表达分析。[001引 图11显示不同碳源下ETI产率的确定。【具体实施方式】 本专利技术设及SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列。 在本专利技术的一个实施方式中，所述核巧酸序列是山梨醇脱氨酶启动子。 在本专利技术的另一个实施方式中，所述核巧酸序列鉴别并分离自己斯德毕赤酵母。 本专利技术设及SEQIDNo. 1的分离方法，所述方法包括W下行为；a)从己斯德毕赤 酵母分离基因组DNA，b)扩增在分离的基因组DNA内包含SEQIDNo. 1的区域，和C)对扩 增产物进行常规凝胶洗脱程序W分离所述SEQIDNo. 1。 在本专利技术的一个实施方式中，通过SEQIDNo. 2所示的正向引物和SEQIDNo. 3 所示的反向引物进行SEQIDNo. 1的扩增。 本专利技术设及在包含非特异性诱导剂的培养基中在SEQIDNo. 1的调控下表达基因 的方法，所述方法包括W下行为；a)在SEQIDNo. 1下游的表达构建体中克隆所述基因，b) 用所述表达构建体转化宿主，和C)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQIDNo. 1 的调控下表达所述基因W产生异源蛋白。 在本专利技术的一个实施方式中，所述宿主是甲基营养型酵母（methylotrophic yeast)，优选己斯德毕赤酵母。 在本专利技术的另一个实施方式中，所述异源蛋白选自包括W下的组；人白蛋白和刺 桐膜蛋白酶抑制剂。 在本专利技术的另一个实施方式中，所述表达是通过非特异性诱导剂进行的。[002引在本专利技术的另一个实施方式中，所述非特异性诱导剂选自包括W下的组；山梨糖 醇、葡萄糖、甘油、果糖、甘露糖醇、乳酸、庶糖、淀粉、甲醇或它们的任意组合。 本专利技术设及包含上述核巧酸序列的载体。 本专利技术设及包含上述载体的转化的宿主细胞。 本专利技术设及对山梨醇脱氨酶启动子的鉴别，其作为在己斯德毕赤酵母中表达异源 重组蛋白的潜在工具，而不需要任何特异性表达诱导。 在本专利技术的一个实施方式中，210bp启动子位于己斯德毕赤酵母的染色体1(1号 染色体）上。 在本专利技术的另一个实施方式中，山梨醇脱氨酶启动子是己斯德毕赤酵母中的最小 启动子。 在本专利技术的一个实施方式中，鉴别山梨醇脱氨酶基因上游可用的启动子区具有位 于该区内的CAAT和GC盒（框，box)。 在本专利技术的另一个实施方式中，该启动子成功用于表达重组蛋白，如人白蛋白 (HA)和刺桐膜蛋白酶抑制剂巧TI)。在本专利技术的另一个实施方式中，在山梨醇脱氨酶启动 子的控制下表达异源蛋白，如人白蛋白和刺桐膜蛋白酶抑制剂。 在本专利技术的另一本文档来自技高网...
【技术保护点】
SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：纳加拉杰·戈文达帕，桑卡尔·佩里亚萨米，什瓦库马尔·马德纳哈利·恰纳巴萨帕，苏马·斯里尼瓦斯，克达纳斯·南祖德·萨斯特里，
申请(专利权)人：拜康有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。