核苷酸序列的概率导向分离(PINS)制造技术

本发明专利技术涉及一种体外方法，其中逐步地提高含有目标DNA片段的靶核苷酸序列的频率，其通过多轮1)稀释含有目标DNA片段的样品至多个复制品(分离)、2)随机扩增复制品中的DNA(浓缩)、3)在至少一个稀释并扩增的复制品中检测目标DNA片段(选择)并且重复步骤1)～3)直到通过标准的测序技术能够对目标DNA片段进行测序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核苷酸序列的概率导向分离(PINS)
本专利技术涉及一种分离包含已知核苷酸序列元件(即，编码保守活性位点或结构域的序列)的复杂核苷酸片段的方法，即，该方法可适用于高通量筛选含有已知序列元件的DNA片段。
技术介绍
一般介绍分子诊断和其它以DNA为基础的方法在诸如Discovery、R&D、和诊断的各个分支等部门已经获得了越来越多的关注。但是，不论检测或筛选所分析的是何种靶，所有的以DNA为基础的方法均面临着同样的挑战，即相对于背景DNA生成足够量的可用的靶。通过提高低丰度的靶DNA的存在，在以复杂的混合DNA样本中不期望的背景DNA为代价下，能够使用传统的分子方法，诸如克隆文库构建、天然产物的发现、PCR诊断、杂交、测序、宏基因组学、以及各种其他分子方法。以下描述了当前使用的方法以及低丰度、混合DNA样本的挑战。PCR诊断近年来，已广泛地开发了用于临床微生物中传染病的常规诊断的PCR检测。PCR适用于直接在临床样本中细菌的快速检测，允许相关疾病的早期、灵敏和特异性的实验室确认[1]。另外，其允许抗生素抗性基因或基因突变的存在的快速评估。组合病原体检测、它们的耐抗生素性的机制、它们的毒力因子以及临床样品中的细菌负荷的方法能在这些感染患者的护理中带来深刻变化。因此，当前正在开发复杂的多重PCR检测以开拓分子诊断的领域。但是，从混合样品基于PCR的诊断经常与挑战相联系，因为PCR产物的存在可以源自混合复杂样品中多于一种DNA的源。特定的抗生素基因的存在结合特定的细菌菌株的存在并不一定意味着抗性细菌菌株存在于原始样品中。其仅表明，在样品中同时存在抗性基因和细菌菌株，它们不一定源自相同的细胞。已经建议了防止这种问题的方法，其中通过特异性引物靶向抗生素抗性基因的整合位点，也称为靶向特异性细菌菌株。但是，由此需要知道准确的整合位点并且这限制了这种方法的使用。DNA测序DNA序列的知识在基础生物学研究和在诸如诊断、生物技术、法医生物学以及生物系统学等许多应用领域已成为不可缺少的。使用现代DNA测序技术获得的快速测序和成本降低一直有助于DNA序列的测序，并且全世界测序的DNA总量迅速增加。虽然纯样品的测序是现在的标准程序，但DNA的混合样品的测序仍然具有挑战性、其昂贵且费时。当靶片段以较低的频率存在于混合核苷酸样品中时，例如在棉签、粪便或血液样品中，首先必须做出克隆或片段文库，然后对所述完整的文库进行测序，或者做出更小的PCR片段并且对其进行测序。完整文库的测序昂贵且耗时，而PCR片段的测序仅在所述序列在非常大的程度上是已知的条件下才是可能的并且会返回相对短的片段，这种相对短的片段不能被分配到同一分子或生物体。如果仅知道靶序列的一部分，那么PCR将是不可能的并且需要宏基因组测序。因此，需要一种用于提高核苷酸分子的混合样品中的稀有核苷酸分子的频率的方法，以便降低测序混合样品的成本和时间。宏基因组学宏基因组学是指一般的测序方法，其中将DNA的复杂混合物区分为小的片断(fractions)并且单独地测序。该系统不依赖于培养性并因此同时适用于可以及不可以在实验室培养的样品。虽然宏基因组学在某些情况下可以被应用到所描述的复杂样品，但是经常的情况是，研究人员更偏好基因组的或基因组混合物的特定子集，而非基因组的一个样品或混合样品的整个序列[2]。因此，仍然强烈需要灵活的靶向方法，其匹配各种技术和研究的个性化要求。虽然此种技术确实存在，但是它们经常基于杂交试验，并且以具有广泛的序列知识为前提条件或者具有低的灵敏度。因此，如果宏基因组学旨在用于分析稀少的/低丰度的DNA片段或靶，则存在对复杂混合物中预定义的子片断的特异性富集的强烈需求。发现不同的行业有不同的动机，以探索处于未发掘的微生物多样性中的广袤的资源。当前，白色(工业)生物技术似乎在可持续发展的现代社会的建立中发挥了核心作用。一种普遍接受的假设是，只有天然微生物生物多样性的一个小的细分可用于筛选。在1990年，Torsvijketal.[3]估计，充其量只有1％的土壤样品的天然存在的微生物多样性可以在实验室条件下培养。因此，在尚未知的天然产物的发现中以及在使得能够进入存在于天然和环境样品的未知的大多数DNA的生物技术中存在巨大的潜力。遗憾的是，如果要获取那些以其它方式无法获得的信息，则需要大量的测序。编码工业相关蛋白质或酶的DNA片段的靶向富集将大大减少所需的测序量。
技术实现思路
本专利技术提供了用于从混合的多核苷酸样品富集和/或分离靶DNA分子的体外方法，其包含步骤：a)提供含有所述靶DNA分子的混合核苷酸样品，其中所述靶DNA分子包含一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列(uniqueconsecutivesequence)，b)连续稀释所述混合多核苷酸样品直至在稀释的样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，优选低于0.50或甚至更优选地低于0.25，和c)复制足够数量的稀释的样品直至在至少一个所述复制稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率为至少0.75，优选0.80～0.95；d)扩增所述复制稀释样品中的DNA以提高每个样品中的DNA丰度；e)检测所述靶DNA分子在步骤(d)中扩增的所述复制稀释样品中的存在或不存在，其中所述靶DNA分子在所述复制稀释样品中的频率与步骤(a)中的混合多核苷酸样品相比被提高；f)连续稀释含有所述DNA分子的至少一个复制稀释样品直至在稀释的样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，并且重复步骤(c)至(e)或(f)至少一次。附图说明图1：本图示出了来自初始混合物的九个阴性PCR反应的2％琼脂糖凝胶。框出区域指示在凝胶中将存在阳性PCR产物。框外部的PCR产物为非特异性产物且在本上下文中被忽略。图2：本图示出了在第一轮PINS之后的十个PCR样品的2％琼脂糖凝胶。五个样品(A、B、C、D&I)含有预期大小的PCR产物，而剩余的五个样品则不含有。在凝胶中用箭头标识了正确的产物大小(左侧)。其它位置的PCR产物(未用箭头标识的)为非特异性产物且在本上下文中被忽略。图3：本图示出了在样品#10再扩增后的十个PCR样品的2％琼脂糖凝胶。六个样品(A、C、E、F、I&J)含有预期大小的PCR产物，而剩余的四个样品则不含有。在凝胶中用箭头标识了正确的产物大小(左侧)。其它位置的PCR产物(未用箭头标识的)为非特异性产物且在本上下文中被忽略。图4：本图示出了在PCR之前使用2E-1稀释的第二轮PINS后的十个PCR样品的2％琼脂糖凝胶。五个样品(C、D、E、G&I)含有预期大小的PCR产物，而剩余的四个样品则不含有。在凝胶中用箭头标识了正确的产物大小(左侧)。其它位置的PCR产物(未用箭头标识的)为非特异性产物且在本上下文中被忽略。图5：本图示出了使用下列参数的两轮PINS的示意图：A：初始样品–具有0.028ng/μl。B：10Phi样品，由A创建,使用3.5μl“A”作为模板。C：一个样品，(三个中)全部3个PCR产物为阳性。D：通过使用3.5μl样品#10在50的总反应体积中再扩增的样品“C”。E：10Phi样品，在每个反应中使用1.0μl作为模板由“D”创建。F&G：两个样品，其中(三个中)全部3个P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集来自混合多核苷酸样品的靶DNA分子的体外方法，其包含步骤：a)提供含有所述靶DNA分子的混合多核苷酸样品，其中所述靶DNA分子包含一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列，b)连续稀释所述混合多核苷酸样品直到在稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，优选低于0.50或甚至更优选低于0.25，和c)复制足够数量的所述稀释样品直到在复制稀释样品的至少一个中检测所述靶DNA分子的概率为至少0.75，优选0.80～0.95；d)在所述复制稀释样品中扩增所述DNA以提高所述DNA在每个样品中的丰度；e)检测所述靶DNA分子在步骤(d)中扩增的所述复制稀释样品中的存在或不存在，其中所述靶DNA分子在所述复制稀释样品中的频率与步骤(a)中的所述混合多核苷酸样品相比得到了提高；f)连续稀释至少一个含有所述DNA分子的复制稀释样品直到在稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，并且重复步骤(c)至(e)或(f)至少一次。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.21 DK PA2012708221.一种从包含DNA分子群的混合多核苷酸样品富集靶DNA分子的体外方法，其包含步骤：(a)提供含有所述靶DNA分子的混合多核苷酸样品，其中所述靶DNA分子包含一个或多个至少10个核苷酸的独特连续序列，(b)连续稀释所述混合多核苷酸样品直到在混合多核苷酸的稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，和(c)通过制备等分试样的方式，产生足够数量的所述混合多核苷酸的稀释样品的复制品直到在复制稀释样品的至少一个中检测所述靶DNA分子的概率为至少0.75；(d)在所述复制稀释样品中扩增所述DNA分子群以提高所述DNA分子群在每个样品中的丰度；(e)检测所述靶DNA分子在步骤(d)中扩增的所述复制稀释样品中的存在或不存在，其中所述靶DNA分子在所述复制稀释样品中的频率与步骤(a)中的所述混合多核苷酸样品相比得到了提高；(f)连续稀释至少一个在步骤(e)中被检测为含有所述靶DNA分子的复制稀释样品直到在稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.75，并且重复步骤(c)至(e)或重复步骤(c)至(f)至少一次，其中，使用超几何分布等式来计算样品中检测所述靶DNA分子的概率：其中：x＝稀释的测试样品中的阳性的数目n＝稀释的测试样品的体积*1000M＝原始样品中靶DNA分子的数目N＝原始样品的体积*1000。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中，连续稀释所述混合多核苷酸样品直到在混合多核苷酸的稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.50。3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中，连续稀释所述混合多核苷酸样品直到在混合多核苷酸的稀释样品中检测所述靶DNA分子的概率低于0.25。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(c)中，通过制备等分试样的方式，产生足够数量的所述混合多核苷酸的稀释样品的复制品直到在复制稀释样品的至少一个中检测所述靶DNA分子的概率为0.80～0.95。5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的混合多核苷酸样品中，所述靶DNA分子相对于非靶DNA分子的频率为10-2和10-7之间。6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)的混合多核苷酸样品中，所述靶DNA分子相对于非靶DNA分子的频率为10-4和10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·奎斯特，玛丽·尤斯特·米克尔森，
申请(专利权)人：赛普有限责任公司，
类型：发明
国别省市：卢森堡;LU