用于快速检测扩增的核苷酸序列的方法和设备技术

本发明专利技术涉及用于扩增和快速检测可能存在于样品中的靶核苷酸序列的方法和设备，其将连续流动PCR扩增与通过毛细管作用在测试条带上的寡色谱检测组合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于快速检测扩增的核苷酸序列的方法和设备
本专利技术涉及用于快速检测来自存在于生物样品中的原始和特定基因序列的(基因)(酶促)扩增的基因序列(扩增子)的方法和设备。该方法优选设计用于包含不同的多个基因靶序列(寡核苷酸)的样品的诊断应用，(i)用于快速且有效地检测样品中的特定核酸序列，以及该检测与该测试样品所来自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病、菌血症、呼吸道或肠道传染病的相关性，包括对于治疗性试剂如抗生素的抗性形式，(ii)用于识别食品的污染物，或(iii)用于预后测试，尤其是检测可能存在于样品中的癌症标记物。
技术介绍
在(基因)扩增方法中，聚合酶链式反应(PCR)是在分子生物学中最常用的用于获得可能存在于生物样品中的一个或多个拷贝的原始和特定核苷酸序列的特异性扩增的技术。通过连续的(基因)扩增循环，该技术允许产生百万甚至千百万的原始和特定序列的拷贝。该PCR扩增方法包括在若干(2个或3个)特定的温度加热和冷却的重复热循环，用于变性该核苷酸序列、用于引物的杂交以及杂交引物的初始核苷酸序列的酶促延长。该方法通过程序化仪器的实现，通过连续的热循环，具体地重复的和连续的温度升高和降低的循环，该程序化仪器加热和冷却包含将要扩增的样品的靶基因序列的固定反应室。通过仪器的加热块(block)的加热和冷却速率限制扩增速率。为了降低用于(多个)PCR扩增的总时间，已提出了多种方法。它们中的一种由连续动态流动下实现PCR扩增组成。用这种技术，可以使得样品在稳定流下通过(微)通道，通过2个或3个不同的空间区域，每个具有恒定的温度。Kopp等的文章(1998,Science280,1046-1048)特别描述了这类设备。该设备包括多次通过具有不同的变性、杂交和延长温度的3个区域的通道。在通道的一端引入样品并且朝着通道的另一端的方向泵入，在该通道的另一端回收该扩增的样品以便于分析。以小型化形式和以连续(恒定)动态流动的(基因)扩增也要求检测扩增的核苷酸序列。在Kopp等的文章中，通过在扩增设备外用溴化乙锭着色的凝胶上的电泳分析该扩增的样品。因为PCR是极其灵敏的扩增技术，因而可以扩增能够污染样品的非常小量的核苷酸序列(特别是来自之前的扩增)，产生假阳性结果。考虑到抑制该缺点，最有效的方法由将该(PCR)扩增步骤以及用于检测该扩增产物的步骤集成至同一闭合且一次性的设备中(一次使用(one-use))组成。存在用于检测的这类集成设备，例如，通过毛细管电泳或通过在微网格板(checkerboard)上杂交。然而，用于测量和分析的这类方法和设备通常是复杂并且是昂贵的。进一步，产生于初步(基因)扩增步骤期间的微泡发射可以干扰这些设备上的检测。因此，存在对于简化这些方法和设备的需要以简化其使用和效率，降低其成本并且增加其使用的速度。专利技术目的本专利技术的目的是提供用于优选通过PCR以连续动态流动的(基因)扩增的方法和设备，结合简单且廉价的、并且不具有现有技术的缺点的检测方法和设备。本专利技术的具体目的是提供这类方法和设备，其允许快速检测，以及有效率的检测，以获得样品中特定核酸序列存在的分析结果，优选样品的快速和未失真诊断，以及可选地该检测与该样品所收集自的个体的不同病理和疾病，具体地感染性疾病，如菌血症、呼吸道和胃肠道感染性疾病的相关性，包括对治疗性试剂、具体地抗生素的抗性的形式。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面涉及优选通过PCR的扩增方法，并且涉及可能存在于生物样品优选(i)从动物或个体如哺乳动物、更具体地人提取的样品，或者(ii)食物组合物的污染物中的至少一种和/或至多达数十种(多重检测)靶核苷酸序列的检测方法，所述方法包括以下连续步骤：a)提供包括以下各项的设备：-具有包含在约0.01mm至约10mm之间的区段的通道，-与所述通道流体连通的测试条带，所述测试条带包括：-与所述扩增的靶核苷酸序列的至少一个第一序列部分互补的第一(一个或多个)和特异性探针，或-由互补且不同的分子的对中的第一分子组成，并且能够特异性地结合至(不同且互补的分子的)所述对中的第二(不同)分子的捕捉试剂(捕获试剂，夺获试剂，capturereagent)，该第二分子结合(直接通过引物，所述引物在优选PCR的扩增期间并入扩增子，或间接通过互补探针)至所述扩增的靶核苷酸序列的所述第一序列部分，以及优选地-用于产生至少4个(3个)优选的不同且恒定温度的区域的装置，所述区域的3个(至少2个)定位在通道的不同位置，而第4(第3)区域定位在测试条带处。这些用于产生优选地不同且恒定温度的3个(至少2个)区域的装置定位在能够产生(基因)扩增步骤的通道的不同位置，而定位在测试条带处的第4(第3)区域在低于其他3个(至少2个)其他区域的值维持恒定，用于有效处理毛细管流(毛细管色谱)的膜(测试条带)上的杂交。在本专利技术的上述方法中，随后(根据步骤b))将用于(基因)扩增的包括样品以及试剂(化合物和可选的添加剂)的溶液引入该设备、具体地本专利技术的设备的通道中，优选用靶核苷酸序列的PCR，以及可选的RT-PCR或MLPA(多重连接依赖式探针扩增)。在将所述扩增的序列(根据步骤d))与测试条带接触前，通过根据动态流动(在流体中)，优选在所述通道中的恒定(或连续)流动使溶液环流(流通，circulate)从而(根据步骤c))产生扩增的和可选地标记的靶核苷酸序列，并且通过在第一探针和所述扩增的序列(以及可选地第二标记探针或标记物插入的DNA)之间的杂交，从而(根据步骤e))产生形成可测量的检测信号的复合物。在本专利技术的方法中，在以闭合的方式设计的步骤a)的设备中产生步骤b)至e)，由此其不能(或仅非常少地)被其他基因序列污染。根据本专利技术的方法，该扩增的序列产生于通道中，该通道包括通过2个(或3个)不同的、恒定的温度的区域并且配置用于优选通过PCR的多个(基因)扩增循环的多个环(环路，loop)。因此，在该通道中，该多个环通过至少2个(优选2个或3个)不同的、恒定的温度的区域，并且配置用于优选通过PCR的多个(基因)扩增循环。优选地，在本专利技术的方法中，将溶液引入(和推送)至具有注射泵(注射器泵)的通道中，并允许样品根据恒定动态流动在通道中移动。也可以引入溶液并使其以恒定动态流动(恒定动态流，constantdynamicflow)在具有抽吸装置的所述通道中移动。也可以通过泵，如蠕动泵(或滚子泵)的方法施加在闭合回路中的恒定动态流动。在本专利技术的方法中，为了促进检测，用于优选通过PCR的(基因)扩增的试剂具体地是(基因)扩增引物的对，其可以可选地被标记。根据该方法的替换形式，也可以获得用标记DNA的插入试剂(例如荧光标记)标记的扩增序列(扩增子)。优选地，标记各对引物中的至少一个。优选地，该引物或扩增序列(扩增子)的标记选自由金属颗粒特别是金颗粒、胶体颗粒、聚苯乙烯颗粒、着色颗粒、(顺)磁性颗粒或荧光成分(元素，要素，element)形成的组。根据本专利技术的方法的优选实施方式，该标记是荧光标记，如花青素(Cy5)或具有类似的荧光特性的标记。有利地，在本专利技术的方法中，该检测信号由通过标记形成的一条或多条线，或通过标记形成的一个或多个点组成，优选该信号由通过标记形成的4、6、8、9、10、12、14或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于PCR扩增和用于检测可能存在于生物样品、优选从个体提取的样品中的至少一种靶核苷酸序列的方法，所述方法包括以下连续步骤：a)提供包括以下各项的设备：‑具有包括在0.01mm至10mm之间的区段的通道(3)，‑与所述通道(3)流体连通的测试条带(4)，所述测试条带(4)包括针对所述扩增的靶核苷酸序列中的至少一个第一序列部分的一种或多种第一互补和特异性探针，或者不同且互补的分子的对中的至少一个第一分子，能够结合来自所述对的第二分子，所述第二分子结合(直接或间接)至所述扩增的靶核苷酸序列的所述第一序列部分；‑用于产生至少4个不同且恒定温度的区域的装置，至少2个(或甚至3个)区域位于所述通道(3)的不同位置，而第4区域位于所述测试条带(4)处，b)将包括所述样品以及用于所述靶核苷酸序列的扩增试剂的溶液引入所述通道(3)中，c)通过使所述溶液在所述通道(3)中根据恒定动态流动环流，产生所述靶核苷酸序列的扩增的和可选地标记的序列，d)使所述扩增的序列与所述测试条带(4)接触，以及e)通过第一探针和所述扩增的序列之间的杂交产生形成可测量的检测信号的复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.04 BE 2012/04581.一种用于PCR扩增和用于检测至少一种靶核苷酸序列的方法，所述方法包括以下连续步骤：a)提供包括以下各项的设备：-具有包括在0.01mm至10mm之间的区段的通道(3)，-与所述通道(3)流体连通的测试条带(4)，所述测试条带(4)包括针对所述扩增的靶核苷酸序列中的至少一个第一序列部分的一种或多种第一互补和特异性探针，或者不同且互补的分子对中的至少一个第一分子，能够结合来自所述分子对的第二分子，所述第二分子结合至所述扩增的靶核苷酸序列的所述第一序列部分；-用于产生至少4个不同且恒定温度的区域的装置，至少2个或3个区域位于所述通道(3)的不同位置，而第4区域位于所述测试条带(4)处，b)将包括样品以及用于所述靶核苷酸序列的扩增试剂的溶液引入所述通道(3)中，c)通过使所述溶液在所述通道(3)中根据恒定动态流动环流，产生所述靶核苷酸序列的扩增的和可选地标记的序列，d)使所述扩增的序列与所述测试条带(4)接触，以及e)通过第一探针和所述扩增的序列之间的杂交产生形成可测量的检测信号的复合物，其中，所述信号的读出与食品的污染物的识别相关。2.一种用于快速扩增和检测至少一种靶核苷酸序列的设备，包括用于应用根据权利要求1所述的方法的装置，并且包括：-具有包括在0.01mm至10mm之间的区段的通道(3)，-与所述通道(3)流体连通的测试条带(4)，所述测试条带(4)包括待检测的扩增的所述靶核苷酸序列的第一序列部分的第一互补和特异性探针，或者不同且互补的分子对中的至少一个第一分子，并且能够结合所述分子对的第二分子，所述第二分子结合至扩增的所述靶核苷酸序列的所述第一序列部分，并且其中，所述通道(3)包括通过3个不同的、恒定的温度的区域并且...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂埃里·勒克利普特，帕斯卡尔·默腾斯，利蒂希娅·阿夫兰，伊莎贝尔·奥特，瓦莱里·斯米肯斯，
申请(专利权)人：可瑞斯生物概念公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE