本发明专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种高效表达重组利拉鲁肽的方法。一种高效表达重组利拉鲁肽的方法，该方法进行基因克隆，转化表达。通过构建重组利拉鲁肽菌株，通过大杆菌表达技术制备利拉鲁肽蛋白，与前面的两种方法比较操作简便，产量高，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及。
技术介绍
利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-1 (GLP-1)类似物，用于治疗糖尿病。 利拉鲁肽为人胰高糖素样肽-1 (GLP-1)类似物，与天然GLP-1分子结构相比有一 个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链，但与天然人GLP-1有95%同源性，保 留了天然GLP-1的功效，它可以结合并激活GLP-1受体，促进促进胰腺0细胞葡萄糖浓度 依赖性地分泌胰岛素，同时以葡萄糖浓度依赖的模式降低过高的胰高糖素的分泌。由诺和 诺德公司研制开发的利拉鲁肽注射剂已被证实在治疗II型糖尿病方面具有良好效果，但需 每日注射给药一次，使患者顺应性较差。 利拉鲁肽肽序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gl n-Ala-Ala_Lys(N-e-(N-a-Palmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu_V al-Arg-Gly-Arg-Gly-OH利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司开发的第一个也是目前唯一一个 长效GLP-1类似物，具有GLP-1受体激动剂作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原 性等方面与GLP-1相似。利拉鲁肽的分子结构与GLP-l(7-37)的同源性达97%，结构差异 表现在Lys34被Arg替代，Lys26经由谷氨酸介导发生棕榈酰化，脂肪酸侧链可以使利拉 鲁肽在血夜中与白蛋白可逆性地结合，使利拉鲁肽的作用时间延长，且增强对DPP-4酶降 解的抵抗，脂肪酸侧链还可以使利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体，从而延缓其自 皮下吸引，使其作用时间可长达接近24小时，每天注射一次并且可在任意时间注射，且低 血糖发生风险小。诺和诺德的利拉鲁肽通过基因工程等生物学方法进行制备，技术难度大， 生产成本高，不利于利拉鲁肽的大规模生产。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的第一目的是提供一种高效表达重组利拉鲁肽 的表达基因片段his6-ek-利拉鲁肽，本专利技术的第二个目的是提供一种高效表达重组利拉鲁 肽的方法，该方法通过基因工程等生物学方法进行重组表达，降低生产成本，污染减少，有 利于利拉鲁肽的大规模生产。 为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： -种高效表达重组利拉鲁肽的表达基因片段HIS6-EK_利拉鲁肽，该表达基因片段 的序列如SEQIDN0 :1所示。 本专利技术还公开了含有上述的表达基因片段的重组表达载体。 作为优选，该重组表达载体为所述的基因片段克隆进入PET-22b载体中获得重组 表达载体PET-22b-HIS6-EK-利拉鲁肽。 作为优选，该重组表达载体采用将分子伴侣troponinCSEQIDN0 :2全长基因连 接到所述的基因片段His6-EK-利拉鲁肽的5'末端，最后一起克隆进入pET-22b载体，即重 组为表达载体pET-22b_troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽。 本专利技术还公开了含有上述的表达基因片段的菌株，该菌株采用表达载体pET-22b-troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽转入到大肠杆菌DE3菌株中，用IPTG储液诱导重 组基因的表达，离心收集菌体。 上述的菌株可以用于重组利拉鲁肽的高效表达。 为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： ，该方法包括以下的步骤： 1)根据利拉鲁肽基因序设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得 优化的基因序列，基因序列5'末端依次增加两段基因序列，分别为肠激蛋白酶切位点序列 EK和HIS标签序列HIS6，得到表达基因片段HIS6-EK-利拉鲁肽，表达基因片段HIS6-EK-利 拉鲁肽的序列如SEQIDN0:1所示；并将基因片段克隆进入PET-22b载体中即为重组表 达载体PET-22b-HIS6-EK-利拉鲁肽，相应表达出的重组蛋白为PET-22b-HIS6-EK-利拉 鲁肽；接着再将分子伴侣troponinCSEQIDN0 :2全长基因序列克隆出来，然后将其连 接到基因片段HIS6-EK-利拉鲁肽的5'末端，最后一起克隆进入pET-22b载体，即重组为 表达载体pET-22b_troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽，相应表达出的重组蛋白为troponin c-his6-ek-利拉鲁肽； 2)将步骤1)中构建好的表达载体pET-22b-troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽转入 到大肠杆菌DE3菌株中，用IPTG储液诱导重组基因的表达，离心收集菌体；PB缓冲液重悬 得到的菌体，超声破碎，离心收集上清液； 3)将2)中得到的troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽蛋白进行初步纯化，通过阳离子 交换树脂进行纯化，缓冲液为PB，20mM，PH7. 5,将troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽蛋白用盐 离子浓度洗脱并收集； 4)将收集洗脱得到的目的蛋白进行镍离子亲和层析，通过HIS标签，将目的蛋白 吸附在镍离子亲和柱上，再用高浓度咪唑进行洗脱； 5)将洗脱蛋白进行脱盐，平衡液为20mM PB ;用EK酶酶切，4°C过夜酶切； 6)最后将酶切产物蛋白经过亲和层析，缓冲液同前，将融合蛋白和利拉鲁肽蛋白 进行分离，流穿的为目的蛋白，洗脱的为杂蛋白。 为了得到和序列完全一致利拉鲁肽蛋白，本专利技术利用肠激蛋白酶去除HIS6的标 签和分子伴侣troponinC，露出其本来的氨基端，这样进入人体后不会产生抗体，具体做法 是将脱盐得到的含有troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽蛋白的溶液调整到pH为6. 0,加入肠 激蛋白酶进一步酶切，最终释放出利拉鲁肽蛋白序列完全一致的蛋白利拉鲁肽。 本专利技术解决如何进行大肠杆菌有效的表达通过基因工程技术方法，进行基因克 隆，转化表达。通过构建重组利拉鲁肽菌株，通过大杆菌表达技术制备利拉鲁肽蛋白，与前 面的两种方法比较操作简便，产量高，成本低。【附图说明】图1为重组利拉鲁肽基因构建的质粒载体。 图2为图1部分放大图。 图3为利拉鲁肽蛋白电泳SDS-PAGE。【具体实施方式】A、编码利拉鲁肽基因的克隆 根据利拉鲁肽基因序设计引物，并替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以获得优化 的基因序列，基因序列5'末端依次增加两段基因序列，分别为肠激蛋白酶切位点序列EK和 HIS标签序列HIS6,得到表达基因片断HIS6-EK-利拉鲁肽，序列如SEQIDN0:1所示。B、表达载体构建 接着再将分子伴侣troponinC全长基因序列克隆出来，序列如SEQIDN0 :2所 示，然后将其连接到基因片断His6-EK-利拉鲁肽的5'末端，用经过相同酶切的质粒和基 因片断通过T4DNA连接酶连接，将连接产物用电转法或42°C热激法转化大肠杆菌BL21， 即重组为表达载体pET-22b-troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽，相应表达出的重组蛋白为 troponinC-HIS6-EK-利拉鲁肽。构建当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效表达重组利拉鲁肽的表达基因片段HIS6‑EK‑利拉鲁肽，该表达基因片段的序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张加慧，封小燕，刘沐荣，刘翔，
申请(专利权)人：杭州北斗生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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