在支持物上固定蛋白质的方法，其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定化蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥，任选地在任选的洗涤步骤后干燥。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术描述本专利技术涉及一种固定并干燥蛋白质、特别是酶、尤其脂肪酶的改进方法。现有技术EP382767描述了一种用于固定脂肪酶的方法。在这种情况下，给定的脂肪酶的水溶液在固定的pH在室温借助转动与树脂(例如)混合。随后通过过滤收集含固定的脂肪酶的树脂，随后用水洗涤并且在降低的压力下干燥。酶固定化通常伴随酶损失，原因在于不结合在支持物上或因已经结合的酶解吸附(“放出”)。另外，固定的酶在固定化的方法步骤期间频繁出现酶活性损失，这导致明显的产率损失和相关的费用增加，特别在产业规模下如此。专利技术描述本专利技术的目的因此是找到允许实现在支持物上高效固定蛋白质的方法，所述方法意味着，存在于支持物上的完整量的酶尽可能永久结合并保留，并且在酶活性蛋白质的情况下，在固定化后获得尽可能与固定化前相同的高度酶活性。已经发现一种在支持物上固定蛋白质的方法，其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定的蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥，任选地在任选的洗涤步骤后干燥。现在已经发现，本文伊始限定的方法导致特别有利的结果，因为固定化的总体步骤，如蛋白质与支持物高效孵育，任选地洗涤固定的蛋白质及干燥固定的蛋白质，在单个装置中实施以产生可以轻易地贮存和运输的稳定产品。如果固定化的蛋白质准备按数百千克规模直至吨规模产生，则这种方法特别良好地适合产业规模。使用本专利技术的方法，可以固定多种蛋白质。它特别适用于固定酶如氧化还原酶、水解酶、异构酶和转移酶。它特别良好地适用于固定水解酶、尤其脂肪酶。在脂肪酶范围内，来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的那些脂肪酶可特别有效地固定，尤其南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)或结构性地从其衍生的这类酶。在结构上衍生自CALB的这类脂肪酶是与CALB多肽序列相比，具有至少一个、优选地两个或更多个氨基酸改变如插入、缺失或置换的脂肪酶。结构上衍生自CALB的这类脂肪酶的例子在WO 2009/080676(“CALB突变蛋白”)中描述，其中WO 2009/080676中关于CALB突变蛋白的公开内容明确地通过引用的方式并入。待固定的酶可以通过已知方法从初始生物分离或也还可以通过重组DNA技术在合适的宿主生物如芽孢杆菌属(Bacillus)、大肠杆菌(E.coli)、毕赤酵母属(Pichia)、金孢属(Chrysosporium)、曲霉属(Aspergillus)和酵母属(Saccharomyces)中产生。合适的支持物是多种有机或无机物质如硅胶、活性碳或聚合支持物。合适的聚合支持物是具有100至1000μm粒度和平均孔半径10-20nm的大孔交联聚合物。特别合适的是大孔交联的丙烯酸酯聚合物如与二乙烯基苯交联的聚甲基丙烯酸酯，所述聚合物可以例如包含丙烯酸、丙烯酸酯、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯。这类聚合物例如由Lanxess按名称VP OC1600或由DOW按名称XAD-7出售。合适的不连续接触式真空混合物干燥器是本领域技术人员从文献已知(例如Friedrich Kneule,\Das Trocknen\[Drying],AG,Aarau,1975,ISBN 3-7941-0429-3)。特别有利的是使用真空转鼓式干燥器或双锥干燥器。充分适合的是具有大于10升、优选大于100升、优选地大于1立方米内部容积的转鼓式干燥器。待固定的蛋白质与支持物在(通常借助缓冲液)调节至特定pH的水相中孵育。pH取决于待固定酶的性质，主要取决于酶的等电点。已经证明3直至11、特别地4至8的pH范围是有利的。4.8-5.2的pH范围推荐用于CALB脂肪酶。用于水相的合适缓冲液例如是磷酸盐和乙酸盐缓冲液。孵育通常在0℃至40℃，尤其4℃至30℃的温度实施。如果待固定酶特别耐受温度，甚至50℃以上的温度可能是合适的。在孵育后，含酶的起始溶液与固定的酶分离。通过过滤法经安装在转鼓式干燥器中的筛板最简单地实施这个步骤。如果需要，固定的酶可以随后在洗涤步骤中纯化。这类洗涤步骤还通过以下方式实施：将固定的酶与洗涤液(通常是水)混合并且随后借助集成过滤装置与固定化酶分离。固定的酶随后还在不进一步转移至不连续接触式真空混合物干燥器的情况下干燥，其中设定干燥器中降低的压力小于1013毫巴、优选地小于100毫巴。调节护套温度至小于100℃，优选地小于65℃，其中必须确保产物温度不超过50℃，优选地不超过40℃。通常不推荐设定待干燥的固定化酶的温度高于50℃以避免酶的热失活。然而，特别在温度不敏感性酶的情况下，这些酶可以甚至在50℃以上干燥。在上文指定的条件下，干燥时间一般是10至30小时，优选地15至20小时。目标通常是提供具有小于5％、优选地小于2％的残余含湿量和特别优选地具有0.5％至1.5％水的固定化产品。如果产品过分干燥，则这导致部分妨碍操作的静电荷。使用本专利技术方法生产的产品易在室温贮存，而不发生活性的明显损失。另外，它易于操作，即它可以轻易地填充和转移。在下文中更详细地描述新方法。实施例：CALB按500kg规模固定在上用于这种方法的T0055转鼓式干燥器具有以下技术数据：·容积：6.3m3·加热表面：17m21.所用原料实验方法需要以下组分：·VP OC 1600潮湿(Lanxess)[544kg]·脂肪酶超滤CALB-2012-01[21kg蛋白质]·脱矿质水(用于3个洗涤步骤[3x 2000L]·N2解吸气[5-20Nm3/小时]根据方案，应当填充总计544kg潮湿Lewatit。这544kg潮湿Lewatit对应于约233kg干燥Lewatit。比活性460TBU/mg的蛋白质和纯度61％的脂肪酶是明确的。总量21kg的酶用于固定化。2.实验方法用装填转鼓式干燥器和第一洗涤步骤·在08:15，开始对Lewatit鼓称量并且随后借助漏斗转移入转鼓式干燥器·将总计544.1kg潮湿Lewatit VP OC1600置于干燥器中从全部转鼓采集混合样品·随后通过管、还通过漏斗，将2000L脱矿质水(借助水表)以流速80-90l/分钟输入干燥器→以这种方式，漏斗无Lewatit残余物·填充过程在08:55完成·通过在干燥器中观察，可以看到水具有略微乳状变色并且一些蛋白质泡沫已经在表面上形成·现在将过滤装置(160μm)安装在检修孔盖上(09:20)·随后将干燥器抽真空至78.6毫巴以检验泄漏·随后释放真空以返回标准压力(1020毫巴)(09:30)·混合物随后在标准压力、室温和以0.33转/分钟混合2小时(为此目的，转鼓式干燥器上的驱动电机设定至5.5Hz，这对应于0.33转/分钟→手工测量：1转/2.43分钟＝0.41转/分钟)→加热浴设定在完全冷却·在2小时过程后(11:26)，使T0055处于盖向下位置并且借助掺入的160μm筛滤除洗涤水至IBC中→将它在100-200毫巴的正压过滤→该正压由输入的氮气产生·在每种情况下在20L，1000L和1700L后取得样品→目视纯净，第一样品具有轻微浊度，然而不沉降在底部→第二和第三样品清亮；迎着光可见小的独立悬浮粒子·排放总计1700L水(11:30–12:25)·允许IBC静置2小时·随后检查悬浮的粒子是否已经沉降在底部；但本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在支持物上固定蛋白质的方法，其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定的蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥，任选地在任选的洗涤步骤后干燥。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.16 EP 13197469.31.一种在支持物上固定蛋白质的方法，其中蛋白质与支持物在不连续接触式真空混合物干燥器中的水相内孵育并且固定的蛋白质随后立即在相同的接触真空混合物干燥器中干燥，任选地在任选的洗涤步骤后干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其中所用的接触真空混合物干燥器是具有超过100L内部容积的转鼓式干燥器。3.根据权利要求1所述的方法，其中所用的蛋白质是酶。4.根据权利要求1所述的方法，其中所用的酶是脂肪酶。5.根据权利要求4所述的方法，其中所用的酶是南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)或从其结构性衍生的脂肪酶。6.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·莫勒，R·拜尔，M·布德，M·柯博尔，F·法里法尔梅马尔，J·道韦尔，T·贝格，S·罗利，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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