一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用。本发明专利技术的发明专利技术人在首次成功重组表达纯化了哈茨木霉的酸性蛋白酶P6281的基础上，首次验证了该酶对动植物病原真菌的抑制作用，同时首次将其应用于果蔬保鲜、生物防治和农作物储存防霉中。所用的蛋白酶来自于哈茨木霉，无毒、安全，且不会对环境造成污染；同时，也克服了目前哈茨木霉菌制剂直接施用于果蔬不适宜其生长，而且有可能引起果蔬腐败等问题。本发明专利技术可与常用的果蔬保鲜技术配合使用，控制贮藏期间果蔬的灰霉病，有效控制采后腐烂。

Application of acidic protease in preparing preparation for inhibiting pathogenic bacteria

The invention discloses an application of an acidic protease in preparing a preparation for inhibiting pathogenic bacteria. The inventor in the first successful expression and purification of recombinant basic acidic protease P6281 of Trichoderma harzianum on the first confirmation of the enzyme to inhibit plant pathogenic fungi, and for the first time applied to the preservation of fruits and vegetables, biological control and storage of crops in mildew. The protease from Trichoderma harzianum, non-toxic, safe, and no pollution to the environment; at the same time, it overcomes the disadvantages of Trichoderma harzianum directly applied to the preparation of fruits and vegetables are not suitable for the growth of fruits and vegetables, but also may cause problems such as corruption. The invention can be used in conjunction with the common preservation technique of fruits and vegetables, and can control the Grey Mildew of fruits and vegetables during storage, and effectively control the Postharvest decay.

【技术实现步骤摘要】
一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用。
技术介绍
灰葡萄孢是一种寄主范围很广的坏死营养型病原真菌，能够引起200多种水果、蔬菜及花卉灰霉病。其在空气中广泛分布，近年来危害越来越大，作物减产率可达60％。灰葡萄孢不仅能够侵染田间作物，同样会给植物的采后阶段造成巨大损失，在所有贮藏发生的病害中，它所造成的损失最为严重。立枯丝核菌是一种寄主范围很广的土传病原真菌，可引起水稻、小麦、棉花和多种蔬菜瓜果等的病害。目前它的分布相当普遍广泛，已经变成了一种世界性病害，它导致作物结实率下降，粒重降低，减产最高可达50％，是作物高产稳产的重大障碍之一。黄曲霉在自然环境中是一种很常见的霉菌，多存在于花生、玉米、大米和小麦等粮食和粮制品中，会引起粮食饲料的储存问题。它也是一种动物的病原菌，会造成肺的曲菌症，有时候也会引起角膜、耳与鼻眼框的感染。黄曲霉产生的黄曲霉毒素是一类致癌物，有剧烈毒性。黄曲霉对食品造成很大的污染，对动物健康有很大危害。烟曲霉是曲霉菌属中致病性最强的霉菌，广泛存在于土壤、粮食、污染的食品和霉腐物中，是引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病的重要致病真菌，也能侵染棉铃和苹果等，引起果实腐烂。卷枝毛霉属于条件致病菌，可以破坏食品的营养成分，导致食用者胃肠道疾病的发生和通过免疫功能低下患者呼吸道、消化道和皮肤等进入人体引起感染而引起致命性的真菌感染毛霉菌病。哈茨木霉是一种存在于几乎所有土壤中的木霉属真菌，它们易于定殖植物根，一些菌株具有根际活性，即能够在根发育时在根上生长。同时哈茨木霉也会通过攻击，寄生其他真菌等方式来获得营养。经过多年的进化，它们已经发展出用于其它真菌的攻击和用于增强植物和根生长的许多机制。作为一种经济有效、安全可持续的菌剂，哈茨木霉也用作杀真菌剂，是目前广泛应用于植物真菌病生物防治的一个最重要生防菌，其抑菌的作用机制和应用研究已经备受关注。它用于叶面施用，种子处理和土壤处理以抑制各种引起疾病的真菌病原体的生长。目前市场上商业生物技术产品如3Tac、T-22、G-41等已经用于治疗葡萄孢属，镰孢属和青霉属引起的真菌性土传病害。目前的研究推测哈茨木霉的抑菌机制有竞争、重寄生、抗生素和刺激宿主免疫等，其中又以重寄生作用最具研究意义。目前其重寄生的机制的研究并不十分清晰，大多数科学家推测其分泌的几丁质酶、葡聚糖酶及蛋白酶等能破坏病原真菌细胞壁，而使其根植在真菌上重寄生。在研究哈茨木霉重寄生作用的机制研究中，2005年Suarez的研究发现，在培养基中添加灰葡萄孢提取的细胞壁组分后，哈茨木霉分泌蛋白2D电泳中，可见多种蛋白的表达明显上调，蛋白酶P6281就是其中之一。随后她通过质谱获得这个蛋白酶部分序列，再通过PCR获得该基因的全长，然后根据蛋白质序列分析获得P6281的理论分子量、等电点、糖基化位点或活性中心等信息。2007年Suarez对哈茨木霉EST序列中发现了61种蛋白酶，其中也包含了P6281。2009年Samolski通过microarray芯片也发现在添加几丁质的培养基中，哈茨木霉也有大量基因表达上调，其中也有p6281。2013年Szabo也报道了在线虫卵上寄生的哈茨木霉中该基因的表达。由此可见P6281可能是哈茨木霉寄生其他真菌和线虫卵过程中的一个重要蛋白酶。然而到目前为止，尚未有人分离纯化过哈茨木霉的P6281蛋白酶，对其性质并没有清楚的研究，也尚未有该蛋白酶有抑制真菌生长的直接证据，也从未有人将其直接应用于抑菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用。本专利技术以哈茨木霉为来源，采用了基因工程的技术方法，从木霉中获得酸性蛋白酶基因p6281，构建重组质粒，然后在毕赤酵母中重组表达，通过亲和层析和分子筛层析对发酵液中的酸性蛋白酶组分进行纯化，首次成功表达纯化得到了可在制备抑制病原菌制剂中的应用的哈茨木霉酸性蛋白酶P6281。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用，所述的酸性蛋白酶为蛋白酶P6281。所述的病原菌优选为植物病原菌、动物病原菌和条件致病菌中的一种或至少两种。所述的植物病原菌优选为灰葡萄孢和/或立枯丝核菌。所述的动物病原菌优选为黄曲霉和/或烟曲霉。所述的条件致病菌优选为卷枝毛霉。所述的抑制病原菌制剂用于果蔬保鲜。所述的果蔬优选为苹果、桔子和黄瓜中的一种或至少两种。所述的抑制病原菌制剂用于果蔬保鲜的方式优选为注射、喷洒、擦涂、浸泡。所述的抑制病原菌制剂在生物防治领域中的应用。所述的生物防治优选为植物病原菌的生物防治。所述的抑制病原菌制剂在农作物储存防霉领域中的应用。所述的蛋白酶P6281优选通过如下步骤制备得到：克隆p6281编码基因，并构建可以表达P6281的菌株，表达蛋白酶P6281，纯化后获得蛋白酶P6281。所述的蛋白酶P6281的编码基因来源于哈茨木霉。所述的哈茨木霉优选为哈茨木霉GIM3.442。所述的菌株优选为毕赤酵母；进一步优选为毕赤酵母GS115。所述的蛋白酶P6281优选通过如下具体步骤制备得到：(1)培养哈茨木霉；(2)提取哈茨木霉总RNA；(3)通过RT-PCR获得p6281编码基因；(4)获取TA克隆与重组质粒的筛选鉴定；(5)将经过鉴定的基因p6281转化毕赤酵母GS115；(6)酸性蛋白酶P6281的发酵诱导及纯化；(7)重组蛋白的SDS-PAGE检测。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1.到目前为止，尚未有人分离纯化过哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人将其直接用于抑菌。本专利技术的专利技术人在首次成功重组表达纯化了哈茨木霉的酸性蛋白酶P6281的基础上，首次验证了该酶对动植物病原真菌的抑制作用，同时首次将其应用于果蔬的保鲜中。2.本专利技术首次将其应用于果蔬的保鲜中。目前，市场上销售的杀菌剂大部分为化学农药，都具有毒性，残留物对人体有害；本专利技术所用的蛋白酶来自于哈茨木霉，无毒、安全，且不会对环境造成污染。另一方面，哈茨木霉菌制剂用于田间，它定植于植物根部，直接施用于果蔬不适宜其生长，而且有可能引起果蔬腐败，使用其蛋白酶制剂则不会有这方面的顾虑。目前常用的果蔬保鲜技术有通风库贮藏、冷库贮藏和薄膜保鲜等，这些技术都可以与酶制剂配合使用控制贮藏期间果蔬的灰霉病，有效控制采后腐烂。附图说明图1是酸性蛋白酶P6281对灰葡萄孢的抑制效果照片图。图2是酸性蛋白酶P6281对立枯丝核菌的抑制效果照片图。图3是酸性蛋白酶P6281对黄曲霉的抑制效果照片图。图4是酸性蛋白酶P6281对烟曲霉的抑制效果照片图。图5是酸性蛋白酶P6281对卷枝毛霉的抑制效果照片图。图6是酸性蛋白酶P6281对灰葡萄孢引起的苹果灰霉病的抑制效果照片图。图7是酸性蛋白酶P6281对灰葡萄孢引起的桔子灰霉病的抑制效果照片图。图8是酸性蛋白酶P6281对灰葡萄孢引起的黄瓜灰霉病的抑制效果照片图。图9是重组表达载体pPIC9BM-p6281的质粒图谱图。图10是实施例3制得的重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中，M表示标准分子量蛋白，泳道1是经过4天发酵诱导后得到的粗酶液，泳道2是经过5天发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用，其特征在于：所述的酸性蛋白酶为蛋白酶P6281。

【技术特征摘要】
1.一种酸性蛋白酶在制备抑制病原菌制剂中的应用，其特征在于：所述的酸性蛋白酶为蛋白酶P6281。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的病原菌为植物病原菌、动物病原菌和条件致病菌中的一种或至少两种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抑制病原菌制剂在果蔬保鲜中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抑制病原菌制剂在生物防治领域中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗晓春，邓俊劲，李志伟，黄伟谦，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44