一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，属于酶工程和淀粉加工技术领域。本发明专利技术采用一种10×普鲁兰酶前处理溶液处理来源于重组菌解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980‑BdP的普鲁兰酶，经过处理的重组酶与土豆淀粉反应获得的反应液中直链淀粉含量比未经处理的重组酶处理同样土豆淀粉后得到的反应液中直链淀粉含量明显提高。本发明专利技术获得的方法在以土豆淀粉为原料的直链淀粉制备中有应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，属于酶工程和淀粉加工
技术介绍
普鲁兰酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中α-1,6糖苷键，形成直链淀粉的解支酶。用普鲁兰酶水解淀粉可以提高淀粉中直链淀粉的含量，在直链淀粉制备工艺中可以通过使用普鲁兰酶来提高直链淀粉的得率。土豆淀粉是一类价格低廉的淀粉原料，是制备直链淀粉的理想原料。本课题组在前期工作中，以解淀粉芽孢杆菌为宿主菌构建了一株表达重组普鲁兰酶的重组菌：解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP [孙娟娟 沈微 石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]。该重组菌产生的重组普鲁兰酶降解土豆淀粉可以提高直链淀粉的产量，但提高幅度不大。采用理化因子对酶进行前处理可以在一定程度上改变酶的性质。本专利技术公开一种对解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP来源的重组酶进行前处理的方法，经过前处理的重组酶催化土豆淀粉获得直链淀粉的得率明显高于未经前处理的酶催化获得的直链淀粉的得率。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对重组菌解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP表达的普鲁兰酶的预处理，改变酶的特性，用其水解土豆淀粉获得的水解液的蓝值比用未经处理的酶液水解土豆淀粉得到的蓝值明显提高，直链淀粉含量提高。本专利技术的技术方案：一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，采用10×普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60℃保温30min，即得到处理后的重组普鲁兰酶。所述10×普鲁兰酶前处理溶液具体为含100 mM柠檬酸-柠檬酸钠、60 mM EDTA-Na2、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、pH3.5±0.5的溶液。所述重组普鲁兰酶酶液具体为采用重组菌解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP进行发酵获得。所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法的应用，以土豆淀粉为原料，用所制得的处理后的重组普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉。（1）重组普鲁兰酶发酵及制备方法：将-70℃甘油管保藏的重组菌解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP在含20 mg/L卡那霉素的LB平板上划线，挑取单菌落。接种含20 mg/L卡那霉素的LB液体培养基。在500 mL三角瓶中装液量为100 mL。200 rpm，34℃摇瓶发酵24 h，按10 %接种量接种5 L发酵罐发酵培养基；发酵过程用氨水控制pH在6.8-7.5；发酵结束后取发酵液于离心管中，12,000 rpm离心10 min，上清液普鲁兰酶酶活一般在20-30 U/mL。取上清液15 mL于3 kD超滤离心管中，12,000 rpm离心10 min，即得普鲁兰酶酶液。此过程中，分子量小于 3kD的小分子物质被过滤到收集管中。酶分子等大于3 kD的分子被截留在上层超滤管中，一般15mL发酵上清液可以被浓缩至0.5 mL左右，酶活一般在600-900U/mL，此浓缩液即为下述普鲁兰酶酶液。将浓缩液取出后，空的超滤离心管可以再次使用，一个离心管一般可以反复使用5次，制取大约2-3mL普鲁兰酶酶液。3 kD超滤离心管为Millipore（密理博）公司产品，型号为：3KD/UFC900396。（2）10×普鲁兰酶前处理溶液配制方法：在1 L容量瓶中加入800 mL去离子水。加入EDTA-Na2·2H2O 22.3 g，无水柠檬酸 15.25 g，无水柠檬酸钠 5.16 g，氯化钠 0.58 g，氯化钾 0.746 g，pH 3.5±0.5，如果pH偏离则用NaOH或 HCl调整pH至3.5±0.5，用去离子水定容至1L，即得10×普鲁兰酶前处理溶液。（3）普鲁兰酶酶液的前处理方法：采用10×普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60℃保温30 min，即得到处理后的重组普鲁兰酶。（4）水解处理：土豆淀粉为原料，以步骤（3）制备所得处理后的重组普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉，并对淀粉蓝值进行测定。淀粉蓝值的测定：蓝值的大小表示着淀粉与碘结合能力的大小，蓝值越大，表示淀粉结合碘的能力越强，线性聚合度越大。淀粉溶液中直链淀粉的含量与蓝值之间存在着接近于线性的关系，淀粉中直链淀粉的含量可以通过蓝值测定进行计算[李彬, 李海普, 张莎莎, 谢涛. 玉米直链淀粉、支链淀粉的分离、表征及浮选应用. 2011，矿产保护与利用, (5-6):64-68 ]，蓝值越高直链淀粉含量越高。直链淀粉的线性聚合度高，故蓝值一般可达到0.8~1.2，支链淀粉的线性聚合度相对较低，故蓝值一般在0.08~0.22。蓝值测定方法一般是参照Gilbert等使用方法[Gilbert GT, Spragg SP. Iodimetric determination of amylase iodine sorption: blue value[C]//Whistler RL. Methods in carbohydrate chemistry. New York: Academic Press, 1964: 168-169.]，操作步骤就是先将样品的酸性水溶液与碘-碘化钾试剂充分混合，取10 mg/100 mL新鲜淀粉溶液于比色管中，加入5 mL碘-碘化钾试剂（含碘5 mg/100 mL）显色5 min。以蒸馏水为空白溶液，使用紫外-可见分光光度仪于400~750 nm范围内扫描，扫描最高峰处的光谱波长就记为最大吸收波长，最大吸收波长处的吸光度记为Aλmax，蓝值计算如式重组普鲁兰酶酶活测定：按文献[Bibel M, Brett C, Gosslar U, et al. Isolation and analysis of amylolytic enzyme of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998, 158:9-15]方法进行。培养基：LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。发酵培养基：乳糖50 g/L，豆饼粉30 g/L，酵母膏0.5 g/L，硫酸铵10 g/L，无水氯化钙0.5 g/L。本专利技术的有益效果：本专利技术在以土豆淀粉为原料以重组菌解淀粉芽孢杆菌 BF7658/pUC980-BdP发酵获得的普鲁兰酶为催化剂制备直链淀粉时可以提高淀粉水解液中直链淀粉的含量。生物材料样品保藏：解淀粉芽孢杆菌/pUC980-BdP，公开于[孙娟娟 沈微 石贵阳 王正祥. 普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达. 工业微生物, 2011, 41(6): 18-22]。附图说明图1是实施例2中 A1溶液淀粉蓝值随时间变化情况示意图。图2是实施例2中 B1溶液淀粉蓝值随时间变化情况示意图。具体实施方式通过实施例对本专利技术作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1：普鲁兰酶发酵液的预处理（1）重组普鲁兰酶发酵及制备方法：将-70℃甘油管保藏的重组菌解淀粉芽孢杆菌 /p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于：采用10×普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60℃保温30min，即得到处理后的重组普鲁兰酶。
【技术特征摘要】
1.一种提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于：采用10×普鲁兰酶前处理溶液与9倍体积的重组普鲁兰酶酶液混合，将混合液在60℃保温30min，即得到处理后的重组普鲁兰酶。2.根据权利要求1所述提高直链淀粉产量的重组普鲁兰酶前处理方法，其特征在于：所述10×普鲁兰酶前处理溶液具体为含100mM柠檬酸-柠檬酸钠、60 mM EDTA-Na2、10mmol/L NaCl、1...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈微，肖亚朋，朱金寸，王冰波，陈献忠，樊游，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。