用于在细胞中体内产生突变体文库方法技术

一种用于在包含许多突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法，其中，一种易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分遗传元件，该遗传元件包括 ｉ）复制起点，复制从此开始， ｉｉ）可有可无的遗传标记，例如，赋予对抗生素的抗性的基因， ｉｉｉ）编码兴趣多肽的基因，该基因不依赖于宿主染色体的复制机制。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于体内产生多肽变体文库，筛选这些变体以及选择那些显示所需性质的变体的方法。本专利技术还涉及用于产生要求的多肽变体的方法。
技术介绍
日益增加的多肽(包括酶和非酶的蛋白质)正在工业上生产，这些多肽用于各种工业、家庭、食品/饲料、化妆品、医药等的用途。这些蛋白质的主要来源之一是而且一直是天然发现的微生物。用于发现这些具有新和特殊性质的多肽的经典方法一直是筛选天然存在的野生型有机体。这曾经是获得多肽的一种十分成功的方法，其中所说的多肽用于如上述的应用的各种领域。然而，如果因为在天然宿主系统中产生的数量太少而不能使得生产，往往不可能产生足够量的这类多肽，即使成本没有问题，要提供适合要求的足够量的多肽(例如人生长激素)，也可能遇到困难。这类问题已通过用于产生多肽的重组技术的出现在很大程度上得以克服。在本领域，多肽通过利用生物系统产生。把编码某些多肽的基因克隆并转移到细胞中，其中该细胞将产生的多肽在量上比那些在原始有机体中产生的大得多。在最近的二十年中，按照这类技术，已发展了大量用于产生多肽的方法。经常，来自天然源的蛋白质不满足某些应用的需要，修饰现有蛋白质使之具有一定活性或生物物理学性质将是必要的。利用辐射(X射线和UV)或化学诱变剂，通过微生物的经典诱变，产生新的蛋白质变体是可能的。然而，由于这种方法是一种十分麻烦且耗时的过程，在相同的最近二十年中，研究者一直在通过利用更具特异性和选择性的重组技术(如用于创造人工多样性的蛋白质和基因工程)发展对现有多肽的改进。利用结构功能的关系与普通蛋白质化学的知识，基于需要考虑的事，研究者已在设计多肽变体方面进行了很久，其中所说的多肽变体显示了各种性质的改进。然而，也已认识到多肽参与的各种相互作用是那么复杂，因此按照这些知识的合理设计有严重的局限性，近年来，利用随机诱变，接着从由诱变产生的大量变体中筛选或选择的方法已引起人们的兴趣。为了这一目的，产生了突变体的微生物文库用于随后的表达与筛选，以测定具有要求的性质的变体。多年来，许多用于创造多肽的大量不同变体的体外和体内DNA诱变技术都已发展。考虑到事实一种典型的天然存在的多肽由100-1000个氨基酸组成，每个氨基酸可以20种方式变化(仅在天然存在的氨基酸内发生)，特定多肽的可能变体的数量是巨大的。由于主要参数(规定或测量微生物收集品或文库的有效性以鉴定多肽的改进变体)是不同变体的数目N，其中所说的不同变体N包含于收集品，所以已出现对大文库的需要。尤其在当一种强大的选择系统可供使用时，鉴定要求的多肽的限制因子是文库的大小。在体外系统情况下，本领域状态下，对N的实际限制是大约108。这主要由于操纵的DNA进入宿主有机体的转化(把DNA引入细胞)的低效能。这个数目从有机体到有机体变化很大，在现存的最好情况大肠杆菌下，通常操纵的DNA的体外转化(例如DNA片段的连接或DNA的化学处理)的效率，最多达到108细菌的文库大小(Greg Winter，现代免疫学方法5:253-255,1993)。极少数这一大小的文库的例子已报导了。在其它原核生物(如Bacillus sp.、Streptococcus sp.或Staphylococcussp.)中的体外文库构建，由于实际原因将是低于这个数目的数量级。考虑到真核生物宿主(如酿酒酵母或各种Aspergillus sp.)，甚至更少数量的转化体可期待来自体外操纵的DNA。已报导了大文库的一种特殊的情况是基于抗体轻链和重链文库的体内重组基于用于那种特殊情况的一个专门设计的系统(Griffiths,A.D.等，1994,EMBO J.14:3245-3260)。许多方法可用以在微生物中体内产生多肽的变体，从十分简单的方法(如利用化学或物理诱变剂处理细胞)到相当复杂的方法，该方法依赖于包含易错的DNA聚合酶但缺乏纠正错误的错配修复系统的细胞(Stratagene,XL1-red(mutS、mutD、mutT)目录#200129)。但这些技术有一主要的弊端，由于诱变的目标不是基因组的特定部分(编码兴趣多肽)，且高频突变也在对细胞必须的基因以及靶基因中产生，导致大量细胞死亡，而且在高数量的细胞中所说的突变不影响兴趣多肽。这类“噪音”将限制突变在靶区域的积累。因此，本专利技术的目的是提供一种特定区域的体内靶诱变方法以产生很大数量N的多肽变体。本专利技术的第二目的涉及利用现有的和未来的技术，筛选或选择具有所需性质的变体。专利技术概述因此，本专利技术涉及用于在包含大量突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法，其中易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分遗传元件，该遗传元件包含ⅰ)复制起点，复制从该点开始，ⅱ)可有可无的遗传标记，例如，编码具有抗抗生素抗性的基因，ⅲ)编码兴趣多肽的基因，该基因不依赖于宿主染色体的复制机制。本专利技术还涉及一种用于产生编码兴趣多肽的所需变体的DNA序列的方法，其中ⅰ)突变体文库利用上述方法产生，ⅱ)在利于所说的兴趣基因表达的条件下，培养所说的文库以产生多肽变体，ⅲ)筛选或选择所说的具有所需性质的变体多肽，鉴定并分离产生这类所需变体的宿主，ⅳ)对所说的宿主中所说的遗传元件测序，以阐明编码所需变体的突变基因的DNA序列；和用于测定编码所需的兴趣多肽的变体的DNA序列的方法，其中(ⅰ)突变体文库用上述方法产生，(ⅱ)把所说的文库在利于所说的兴趣基因表达的条件下培养，以产生变体多肽，(ⅲ)筛选或选择具有所说的所需性质的变体多肽，鉴定并分离产生所需变体的宿主，(ⅳ)对所说的宿主中所说的遗传元件测序，以阐明编码所需变体的突变基因的DNA序列。文库的筛选或变体的选择取决于特定多肽，及它的所需改进和/或保持的性质。因此，对每种情况建立筛选方案是必要的。这类方案包括文献中描述的许多检验(Clackson等，自然352:624-628,1991,Bryan,P等，蛋白质1:326-334,1986)。产生多样性的结合并选择具有所需性质的变体的优雅的途径将是本专利技术的以噬菌体显示系统体内产生多样性的方法的结合(Greg Winter，同上)。兴趣多肽的特定例子是碱性蛋白酶，该酶用于从织物除去蛋白质污点的去污剂工业。在那种情况下，筛选可在实际去污剂组合物中完成以调查性质(如热稳定性、氧化稳定性、存储稳定性、底物特异性以及亲和性、对不含水的溶剂的稳定性、pH轮廓、离子强度依赖性、催化效率和洗涤性能)。本专利技术还涉及用于产生所需的多肽变体的方法，其中(ⅰ)把编码已经按照上述方法测定的兴趣多肽的DNA序列以一定的方式引入合适的宿主中，以便此序列可在所说的宿主中表达，(ⅱ)在利于所说的DNA序列表达的条件下培养所说的宿主，并且(ⅲ)回收所说的多肽变体。用于引导选择的DNA序列进入合适的宿主系统的方法在(Sambrook等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY.)中描述。选择合适的生长培养基和选择的宿主系统的其它条件也在技术人员的能力之内，这些条件利于兴趣多肽变体的表达。有关这些内容的指导可在(Sambrook等，同上)中找到。用于多肽回收的大量方法也可供蛋白质的分离与纯化使用，例如，在(Scopes,R.K.,蛋白质纯化(1987)，Springer-Verlag)。最后，本专利技术涉及用上述方法产生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：T·V·伯彻特，S·D·埃尔利克，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：