本发明专利技术涉及基因工程和遗传工程领域，提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋‑2突变体EtMIC2‑2119，该突变体是以野生型柔嫩艾美耳球虫SD‑01的EtMIC2(GenBank:KC333870.1)为基础蛋白质进行体外定向进化，并建立基因突变库，使用酵母表面展示蛋白突变库，应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手段，筛选免疫原性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质最终获得的，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸突变位点；变异后的EtMIC2较天然EtMIC2免疫保护效果ACI提高约为25.06％，可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和遗传工程领域，提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtMIC2-2119。
技术介绍
鸡球虫病是一类由专性细胞内寄生的艾美耳球虫引起的肠道原虫疾病。据估计每年全世界用于预防和治疗球虫病成本会超过30亿美元，中国每年约有30多亿人民币。目前球虫病的防控主要依靠药物与疫苗，随着耐药虫株的出现和针对抗球虫药物的立法限制，人们更加重视免疫预防。市场上的疫苗主要为多种鸡艾美耳球虫活卵囊的混合，具有很好的免疫保护效果，但是由于活疫苗存在安全问题以及较高的生产成本，研究者们将更多的精力用于以亚单位为基础的新型分子疫苗的研制。新型分子疫苗研制依靠具有较好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球虫复杂的抗原结构以及生活史，抗原鉴定的难度以及抗原免疫原性筛选的限制阻碍了亚单位疫苗研制的进展。研究者们也开展了大量的研究来改善抗原的免疫保护效果，包括新佐剂的研制，益生菌诱导的非特异性免疫等，但是这些都不能从根本上改善抗原的免疫原性。因此，如何获得一种高效的新疫苗成为亟待解决的问题之一。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtMIC2-2119及其编码基因，该突变体是以野生型柔嫩艾美耳球虫SD-01的EtMIC2(GenBank:KC333870.1)为基础蛋白质进行体外定向进化，并建立基因突变库，使用酵母表面展示蛋白突变库，应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手段，筛选免疫原性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质最终获得的，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸突变位点。变异后的EtMIC2-2119较天然EtMIC2免疫保护效果ACI提高约为25.06％，可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。专利技术人在本专利技术中应用的主要机理如下：定向进化被广泛用于蛋白质工程领域，其中重要的应用之一就是改善抗原的免疫原性。关键氨基酸的改变对于抗原的免疫反应和免疫识别有很大影响，比如可逆抑制宿主的免疫反应、影响T细胞的激活、改善蛋白质免疫原性等，使用随机突变构建基因突变库是定向进化常用的方法之一。而EtMIC家族蛋白质在球虫移行、入侵宿主细胞以及胞内生存方面有重要的作用，EtMIC2蛋白质能够在柔嫩艾美耳球虫的整个生活周期内都表达，研究表明EtMIC2基因或者蛋白质能够诱导部分免疫保护反应，是很好的疫苗候选抗原。因此本专利技术的专利技术人使用随机突变技术针对EtMIC2进行定向进化，建立基因突变库，使用酵母表面展示技术结合FACS以及动物免疫保护试验筛选目的变异蛋白质，从而改善EtMIC2蛋白质的免疫原性，为抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染提供技术支持。本专利技术的具体技术方案如下：本专利技术首先根据GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列(GenBank:KC333870.1)人工合成天然EtMIC2序列，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示，将该EtMIC2核苷酸序列与pEASY-T1载体连接建模EtMIC2-T1。专利技术人利用易错PCR扩增上述EtMIC2-T1并获得突变体，之后建立基因突变库，使用酵母表面展示蛋白突变库，而后应用流式细胞仪分选以及动物免疫保护效果评价等手段，筛选免疫原性以及免疫保护力显著提高的变异蛋白质，最终获得了本专利技术所述的突变体，命名为EtMIC2-2119，该突变体核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示，通过与未突变EtMIC2比较，该突变体变异蛋白质有11个氨基酸突变位点，具体突变 位置如下：EtMIC2-2119与EtMIC2相比差异氨基酸及其位点专利技术人在获得上述突变体之后，对其进行了免疫保护效果验证，结果发现相比于未突变的EtMIC2蛋白质，突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组体重增长显著；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组的盲肠平均病变计分要显著低于未突变EtMIC2免疫组；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组在克粪便卵囊数方面与天然蛋白EtMIC2相比，卵囊排出量虽有所减少，但没有表现出明显差异；突变体EtMIC2-2119蛋白质免疫组的ACI为172.48，比未突变EtMIC2蛋白免疫组高约25.06％，具有良好的抗球虫效果，可见本专利技术所提供的突变体EtMIC2-2119可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。综上所述，本专利技术获得了一种全新的鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体EtMIC2-2119，该突变体较之为突变体免疫保护效果ACI提高约为25.06％，可作为疫苗在抵抗鸡柔嫩艾美尔球虫感染等领域中应用。附图说明图1为酵母表面展示蛋白质EtMIC2以及突变EtMIC2蛋白质SDS-PAGE检测结果灰度图，图中M为Marker；1为EBY100阴性对照；2为EtMIC2蛋白质；3为EtMIC2-2119变异蛋白质；图2为酵母表面展示蛋白质EtMIC2以及突变EtMIC2蛋白质Western blot检测结果灰度图，图中M为Marker；1为EtMIC2蛋白质；2为EtMIC2-2119变异蛋白质；图3为流式细胞仪分选展示有EtMIC2蛋白的酵母细胞示意图。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株、载体：本专利技术所涉及的各种菌株均为常规菌株，可从市场上直接够得；所采用的克隆载体pEASY-T1购自全式金公司；表达载体pET-30a(+)，采用本领域常规技术获得或购买。2、主要试剂与药品：rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、Protein Marker、PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶BamH I、Nhe I、HindⅢ和Sal I购自大连宝生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自Fermentas；FITC标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗鼠IgG和IgA购自北京博奥森生物科技有限公司；Quick StartTMBradford 1x Dye Reagent购自Bio-Rad公司；His·Purificat ion Kit购自Merck公司；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂等购自Sigma公司；二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；酵母质粒快速提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，其它常规试剂均为国产分析纯。3、培养基的配制：(1)LB液体培养基：使用电子天平称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，溶解于1L去离子水中，121℃高压灭菌20min。(2)固体LB培养基：按以上方法配制LB液体培养基100mL，加入1.5g琼脂粉，121℃高压灭菌20min，冷却后倒入培养皿中。(3)固体LB/AMP(Kan)培养基：按以上方法配制LB液体培养基100mL，待温度降至不烫手时，加入100μL Amp(Kan)贮存液，混匀后，倒入培养皿中，冷却后4℃保存。(4)YPD液体培养基：使用电子天平称取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g溶解于1L去离子水中，121℃灭菌15min。(5)固体YPD培养基：按以上方法配制YPD液体培养基100mL，加入1.5g琼脂粉，121℃ 高压灭菌20min，冷却后倒入培养皿中。(6)SD-CAA液体培养基：使用电子天平称取酵母氮源6.7g，酸水解酪本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋‑2突变体，其特征在于，该突变体命名为EtMIC2‑2119，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋-2突变体，其特征在于，该突变体命名为EtMIC2-2119，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，其编...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵孝民，陈正涛，韩林臻，李宏梅，王方昆，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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