一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的应用，具体地，本发明专利技术提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，它具有高酶活性和高热稳定性，能够高效催化产生阿洛酮糖。

【技术实现步骤摘要】
一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用
本专利技术涉及酶的基因工程
，具体地，本专利技术涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用。
技术介绍
D-阿洛酮糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等生理功能。2011年FDA认可甜味剂D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用，自此D-阿洛酮糖得到了迅速发展,市场上出现了多种含D-阿洛酮糖的产品,像糖尿病患者就应选择此类低热量安全性高的甜味剂,此类甜味剂可以使患者在维持健康膳食的前提下同样享受甜蜜滋味。在自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。其中，化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。当前有两种异构化酶可以实现将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖：D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase，缩写为DPE)和D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose-3-epimerase，缩写为DTE)。对于这两种异构酶，已经发现的有RhodobactersphaeroidesSK01来源的DTE酶，ClostridiumcellulolyticumH10来源、Ruminococcussp.来源和Clostridiumscindens来源的DPEase酶。然而，这些酶有很多问题，比如，得到的阿洛酮糖的产量低，转化效率低，活性低等。因此，本领域迫切需要开发一种具有高酶活性，高热稳定性，并且能够高效催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间转化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高酶活性，高热稳定性，并且能够高效催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间转化的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。本专利技术第一方面提供了一种生产阿洛酮糖的方法，包括步骤：(a)在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和(b)任选地，分离阿洛酮糖。在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自下组：(i)氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示的多肽；(ii)将SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽；(iii)序列中含有(i)或(ii)中所述按氨基酸序列的衍生多肽；(iv)氨基酸序列与SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽。在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特性：(p1)适合的pH：5-10，较佳地，6-9，更佳地，8-9；(p2)适合的温度：20～80℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃；(p3)催化活性：在pH7.0和60℃为最佳反应条件下，催化活性为100％；(p4)在pH7.0和60－70℃下，转化反应2h，转化率为5-30％，较佳地，25-30％；(p5)在最适pH±0.5下，在80℃下的催化活性A80与在60℃下的催化活性A60之比(A80/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p6)在最适pH±0.5下，在50℃下的催化活性A50与在60℃下的催化活性A60之比(A50/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p7)在最适pH±0.5下，在45℃下的催化活性A45与在60℃下的催化活性A60之比(A45/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p8)在T1温度下，在pH5.5下的催化活性ApH5.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH5.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；(p9)在T1温度下，在pH8下的催化活性ApH8与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH8/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；(p10)在T1温度下，在pH9.5下的催化活性ApH9.5与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH9.5/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；(p11)在T1温度下，在pH10下的催化活性ApH10与在pH7下的催化活性ApH7之比(ApH10/ApH7)≥60％(如60-90％)，较佳地≥65％(如65-80％)；其中T1为40-70℃中任意温度，较佳地T1为50、60、65℃。在另一优选例中，在步骤(a)中，在一反应体系中进行反应。在另一优选例中，所述的反应体系含有：(A)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；(B)反应底物，所述反应底物包括果糖；和(C)缓冲体系。在另一优选例中，在所述反应体系中，所述底物的浓度(w/w)为1-80％，较佳地，3-70％，更佳地，8-65％，按反应体系的总重量计算。在另一优选例中，在所述反应体系中，所述差向异构酶的浓度(w/w)为1～20％，较佳地，2-10％，更佳地，3-7％，最佳地，5％。在另一优选例中，所述差向异构酶与底物果糖之比为10-80U:1g，较佳地，30-70U:1g，更佳地，40-60U:1g，最佳地，50U:1g。在另一优选例中，反应体系的pH为5.5-9.5，较佳地，6-9，更佳地，8-9。在另一优选例中，反应体系的pH为6.0-9.5，较佳地，6-8，更佳地，6.5-7.5。在另一优选例中，反应体系的温度为40-90℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃。在另一优选例中，反应体系的温度为30-70℃，较佳地，35-60℃，更佳地，35-50℃。在另一优选例中，步骤(a)中，反应温度为70-90℃，较佳地，70-80℃，或80-85℃。在另一优选例中，在步骤(a)所述阿洛酮糖的转化率为5-30％，较佳地，25-30％。在另一优选例中，所述反应时间为1－5小时。在另一优选例中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶包括游离态的酶、固定化酶。在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是原位产生的。在另一优选例中，在步骤(a)中，在发酵体系中进行反应，所述发酵体系中含有产生所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的生产菌。在另一优选例中，所述的生产菌包括重组的工程菌。在另一优选例中，所述的工程菌包括大肠杆菌、酵母、或杆菌。在另一优选例中，所述的生产菌包括类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)。本专利技术第二方面提供了一种催化反应体系，所述的反应体系包含(A)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶；(B)反应底物，所述反应底物包括果糖；和(C)缓冲体系。在另一优选例中，在所述反应体系中，所述底物的浓度(w/w)为1-80％，较佳地，3-70％，更佳地，8-65％，按本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和(b)任选地，分离阿洛酮糖。

【技术特征摘要】
1.一种生产阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在D-阿洛酮糖-3-差向异构酶存在下，对底物进行酶促反应，从而形成产物阿洛酮糖，其中所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为类芽孢杆菌(Paenibacillussenegalensis)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，并且所述的底物包括果糖；和(b)任选地，分离阿洛酮糖。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自下组：(i)氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示的多肽；(ii)将SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的多肽经过一个或多个氨基酸残基(较佳地，1-50个，更佳地，1-30个，更佳地，1-10个，最佳地，1-6个)的取代、缺失或添加而形成的、或是添加信号肽序列后形成的、并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽；(iii)序列中含有(i)或(ii)中所述按氨基酸序列的衍生多肽；(iv)氨基酸序列与SEQIDNO.:1所示氨基酸序列的同源性≥70％(较佳地≥80％，更佳地≥90％)，并具有催化产生阿洛酮糖活性的衍生多肽。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有选自下组的一个或多个特性：(p1)适合的pH：5-10，较佳地，6-9，更佳地，8-9；(p2)适合的温度：20～80℃，较佳地，50-80℃，更佳地，60-70℃；(p3)催化活性：在pH7.0和60℃为最佳反应条件下，催化活性为100％；(p4)在pH7.0和60－70℃下，转化反应2h，转化率为5-30％，较佳地，25-30％；(p5)在最适pH±0.5下，在80℃下的催化活性A80与在60℃下的催化活性A60之比(A80/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p6)在最适pH±0.5下，在50℃下的催化活性A50与在60℃下的催化活性A60之比(A50/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p7)在最适pH±0.5下，在45℃下的催化活性A45与在60℃下的催化活性A60之比(A45/A60)≥50％(如50-80％)，较佳地≥60％(如60-65％)；(p8)在T1温度下，在pH5.5下的催化活性ApH5.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴会广，余允东，祝俊，牛志国，任世阔，周晓青，陈风义，
申请(专利权)人：上海立足生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31