热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体和使用其的D-阿洛酮糖的连续制备制造技术

本发明专利技术涉及通过取代特定序列号的氨基酸改善热稳定性的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。此外，本发明专利技术涉及包括D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体基因的重组载体，和使用所述重组载体转化的重组菌株。另外，本发明专利技术涉及使用酶突变体或重组载体制备的固定化反应器，以及使用所述固定化反应器制备D-阿洛酮糖的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体和使用其的D-阿洛酮糖的连续制备
本专利技术涉及来源于根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体和使用其制备D-阿洛酮糖的方法。
技术介绍
D-阿洛酮糖是一种被认为是稀有糖的单糖，因为它很少在天然材料中被发现或以少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量密度和与糖类似的甜味，并且因此被广泛用作功能性甜味剂。D-阿洛酮糖是果糖的差向异构体并且具有非常类似于果糖的甜度和味道。然而，与果糖不同，D-阿洛酮糖几乎不在体内代谢并且因此具有几乎零卡路里。D-阿洛酮糖可用作减肥食品的有效成分，这是因为D-阿洛酮糖具有抑制脂质合成所涉及的酶的活性和减少腹部肥胖的能力。另外，被广泛用作糖替代物的糖醇(如木糖醇等)可能具有副作用，如在过度消耗的情况下导致腹泻。相反地，已知D-阿洛酮糖实质上不具有副作用(松江(Matsue)，T.，Y.马场(Baba)，M.桥口(Hashiguchi)，K.竹下(Takeshita)，K.何森(Izumori)，以及H.铃木(Suzuki).2001.食用D-阿洛酮糖，D-果糖的C-3差向异构体，抑制大鼠肝脏脂肪生成酶的活性(DietaryD-psicose，aC-3epimerofD-fructose，suppressestheactivityofhepaticlipogenicenzymesinrats.)亚太临床营养杂志(AsiaPac.J.Clin.Nutr.)10：233-237.；松尾(Matsuo)，T.，和K.何森2004.D-阿洛酮糖，不提供能量并且提供额外有利的临床营养作用的稀有糖(D-psicose，araresugarthatprovidesnoenergyandadditionallybeneficialeffectsforclinicalnutrition.)亚太临床营养杂志13：S127)。由于所述原因，D-阿洛酮糖作为食用甜味剂引起强烈的注意，并且对开发食品工业中用于有效制备D-阿洛酮糖的方法存在不断增长的需求。随着开发D-阿洛酮糖的必要性的提高，已进行许多使用常规生物学方法由果糖制备D-阿洛酮糖的研究。作为能够将果糖转化成D-阿洛酮糖的酶，已知来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶和来源于菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)或类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的D-塔格糖3-差向异构酶。已知D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有比D-塔格糖3-差向异构酶更高的活性。属于棒状杆菌属(genusCorynebacterium)的菌株是制备包含L-赖氨酸、L-苏氨酸和在饲料、药品、食品等中具有不同用途的多种核酸的化学物质的工业微生物。所述棒状杆菌属的菌株是公认为安全的(GenerallyRecognizedAsSafe；GRAS)菌株，并且具有易于被基因工程改造和大量培养的特性。此外，棒状杆菌属菌株具有在多种加工条件下的高稳定性和与其他细菌相比相对强大的细胞膜结构。出于这些原因，菌株具有以下生物学特性：细菌细胞由于高糖浓度等而在高渗透压下以稳定状态存在。[现有技术文献]1)韩国专利第10-0744479B1号(在2007年8月1日公开)2)韩国专利公开第10-2011-0035805A号(在2011年4月6日公开)
技术实现思路
技术问题本专利技术的专利技术人发觉来源于根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶尽管活性高，但因低热稳定性而具有不良效用的问题，并且开发出热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，使得目前作为重要的食品材料引起高度注意的D-阿洛酮糖可被大规模工业制备，从而提供一种使用所述变异体连续制备D-阿洛酮糖的方法。基于所述研究，本专利技术的专利技术人已得出本专利技术。确切地说，本专利技术旨在提供通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。本专利技术的一个实施例还旨在提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。另外，本专利技术旨在提供一种使用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株制备的填充床反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。技术解决方案本专利技术提供一种通过取代在野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定位置的氨基酸而使热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。另外，本专利技术提供一种包含D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体基因的重组表达载体和一种用所述重组表达载体转化的重组菌株。此外，本专利技术提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体或重组菌株制备的固定化反应器和一种使用所述固定化反应器连续制备D-阿洛酮糖的方法。更确切地说，本专利技术的一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。本专利技术的另一个实施例提供一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代且在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。本专利技术的又一个实施例提供一种包含编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体的基因的重组表达载体。本专利技术的又一个实施例提供用重组表达载体转化的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)pFIS-1-ATPE-2。本专利技术的又一个实施例提供一种使用D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体由果糖制备D-阿洛酮糖的方法。本专利技术的又一个实施例提供一种使用重组谷氨酸棒状杆菌pFIS-1-ATPE-2由果糖制备D-阿洛酮糖的方法。本专利技术的又一个实施例提供一种用于制备D-阿洛酮糖的固定化反应器，包括用珠粒填充的管柱，其中D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体被固定到所述珠粒。本专利技术的又一个实施例提供一种通过将果糖溶液引入固定化反应器中制备D-阿洛酮糖的方法。有益效果本专利技术提供一种野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列的特定位置的氨基酸被取代的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体。D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体具有以下优势：所述变异体在保持酶促活性的同时具有显著改善的热稳定性，从而使得目前作为重要的食品材料引起高度注意的D-阿洛酮糖可被更有效地大规模工业制备。确切地说，与野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，根据本专利技术的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体在一般酶反应温度下具有明显延长的半衰期，从而使得所制备的D-阿洛酮糖3-差向异构酶可被用于长时间制备D-阿洛酮糖。因此，根据本专利技术的D-阿洛酮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热稳定性得到改善的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的变异体，并且具有在氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被由亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)以及缬氨酸(Val)所构成的族群中选出的氨基酸取代的氨基酸序列，或在氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.24 KR 10-2011-00847121.一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)ATCC33970的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且其氨基酸序列为野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被亮氨酸(Leu)或半胱氨酸(Cys)取代的氨基酸序列，或为野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列位置213的丝氨酸(Ser)被半胱氨酸取代的氨基酸序列。2.一种热稳定性得到改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变异体，其中所述变异体为来源于根癌土壤杆菌ATCC33970的野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变异体，并且其氨基酸序列为野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶氨基酸序列位置33的异亮氨酸(Ile)被亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)或缬氨酸(Val)取代且在野生型D...

【专利技术属性】
技术研发人员：金良姬，金镇夏，李英美，洪暎镐，金敏会，金成俌，朴承源，吴承贤，吴德根，崔珍根，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR