本发明专利技术一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法，公开了一种微生物发酵法合成D-阿洛酮糖的方法。首先构建携带有L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因（即具有醛缩途径）的重组谷氨酸棒杆菌SY12，其次在基本盐培养基中添加葡萄糖和D-甘油醛，葡萄糖经胞内的糖酵解途径合成磷酸二羟丙酮，D-甘油醛和磷酸二羟丙酮（DHAP）在谷氨酸棒杆菌重组菌株SY12携带的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶和果糖-1-磷酸化酶的作用下合成单一产物D-阿洛酮糖，D-甘油醛转化率为53%。因此，本发明专利技术的D-阿洛酮糖的生物合成方法与目前通过酮糖3-差向异构酶体外合成D-阿洛酮糖的方法相比，具有转化率高，产物单一，便于分离等优点，为D-阿洛酮糖的大规模生产打下一定基础。
【技术实现步骤摘要】
一种利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法
本专利技术涉及生物
，具体地说是涉及利用醛缩酶全细胞合成D-阿洛酮糖的方法。即利用基因工程技术和微生物学方法获得谷氨酸棒杆菌重组菌株，并利用该重组菌株高效合成D-阿洛酮糖。
技术介绍
稀少糖（RareSugar）是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物（2002年国际稀少糖学会ISRS定义）。其具有热量低、稳定性高、无致龋齿性、耐受性高等优点，在膳食、保健、医药等领域引起了广泛关注，它们可以作为添加剂改善食品的理化性质，提高食品的生理功能和保健功能。近年来，科学家致力于研究的稀少糖主要有D-阿洛糖（D-Allose）、D-阿洛酮糖（D-psicose）、D-塔格糖（D-Tagatose）等。其中D-阿洛酮糖（果糖C-3差向异构体）是一种重要的稀少糖。研究人员分别证实了D-阿洛酮糖是零或低热量、食用安全的填充型甜味剂，它们对胰岛素没有依赖性，可改善糖尿病患者的饮食，适合于糖尿病患者食用，是低热量功能性的理想蔗糖替代品（MatsuoT,SuzukiH,HashiguchiM,etal.D-psicoseisararesugarthatprovidesnoenergytogrowingrats.J.NutrSciVitaminol(Tokyo).2002.48(1):77-80.）。美国食品与药品管理局（FDA）在2012年就将D-阿洛酮糖列为安全食品（GRAS）添加剂。国际市场对D-阿洛酮糖的应用越来越关注，市场需求量不断增大。然而，D-阿洛酮糖在自然界中含量低、且难以化学合成，传统的化学合成法已不能满足大规模的生产需要。因此，从来源于自然界中的丰富原料通过生物转化的方法合成稀少糖，实现规模化生产是D-阿洛酮糖广泛应用的基础。日本的研究学者Izumori于2002年建立了稀少糖的生物转化生产策略，即Izumoring方法，该方法中利用酮糖差向异构酶(Ketoseepimerase)、醛糖异构酶(Aldoseisomerases)和多元醇脱氢酶(Polydehydrogenase)进行所有单糖及糖醇之间的相互转化（IzumoriK.Bioproductionstrategiesforrarehexoses.Naturwissenschaften,2002,89:120-124.）。目前，生物转化法合成D-阿洛酮糖主要是通过酮糖3位差向异构酶完成，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。该酮糖3位差向异构酶酶系根据其作用最适底物分为：D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose3-epimerase，DTEase）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose3-epimerase，DPEase），它们的催化效率为20-32％。此外，来源于根癌农杆菌（A.tumefaciens）的DPE（D-阿洛酮糖3-差向异构酶）和菊苣假单胞菌（P.cichorii）的DTE（D-塔格糖3-差向异构酶）也可以将D-果糖转化为D-阿洛酮糖（KimHJ,HyunEK,KimYS,LeeYJ,OhDK(2006a)CharacterizationofanAgrobacteriumtumefaciensD-psicose3-epimerasethatconvertsD-fructosetoD-psicose.ApplEnvironMicrobiol72:981–985）。近年来研究发现醛缩酶同样可用于稀少糖的生物合成（BrovettoM,GamenaraD,SaenzMendezP,SeoaneGA.C-Cbond-forminglyasesinorganicsynthesis.ChemicalReviews2011.111:4346-4403）。例如L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶可以以磷酸二羟丙酮和D-甘油醛为底物合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖（LiZ,CaiL,QiQ,WangP.EnzymaticsynthesisofD-sorboseandD-psicosewithaldolaseFucA:Effectofacceptorconfigurationonenzymestereoselectivity.Bioorg.Med.Chem.Lett.2011).21.7081–7084）。上述D-阿洛酮糖的生物合成方法中存在一个共性问题，即反应终止时，反应液含有两种及两种以上的单糖，导致分离成本提高。所以开发一种能够合成单一产物D-阿洛酮糖的生物合成方法很有意义。目前，与D-阿洛酮糖合成相关的国外专利主要通过3-差向异构酶及其固定化体外催化果糖来合成（Deok-KunOh,Hye-JungKim,Yong-JooLee,Sang-HoonSong,Seung-WonPark,Jung-HoonKim,Seong-BoKim.D-psicoseproductionmethodbyD-psicoseepimerase.US8030035B2,2011.10.04;YangHeeKim,JinHaKim,YoungMiLee,YoungHoHong,MinHaeKim,SeongBoKim,SeungWonPark,SeungHyunOh,DeokKunOh,JinGeunChoi.D-psicose3-epimerasemutantwithimprovedthermalstability,andcontinuousproductionofD-psicoseusingsame.US2014/0199732A1,2014.07.17;YoungPloHong,JinHaKim,SungBoKim,JungHoonKim,YoungMiLee,SeungWonPark.Immobilizationofpsicose-epimeraseandamethodofproducingD-psicoseusingthesame.US8735106B2.2014.05.27）。由于3-差向异构酶催化果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率仅有20-32%，故反应终止时，体系中同时含有果糖和D-阿洛酮糖，导致分离操作较复杂，成本较高。来源于大肠杆菌的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶可以催化磷酸二羟丙酮和D-甘油醛体外合成单一产物D-阿洛酮糖，但是由于磷酸二羟丙酮价格较贵，且不稳定，所以很难进行大规模体外合成。然而磷酸二氢丙酮还可以以葡萄糖，果糖，蔗糖为底物，通过胞内的糖酵解途径实现体内合成，所以通过构建重组菌株以葡萄糖和D-甘油醛为底物全细胞转化合成D-阿洛酮糖具有很大的应用潜力。目前国内外相关专利尚未报道。因此，通过基因工程和代谢工程的方法和思路构建微生物重组菌株，再以葡萄糖和D-甘油醛为底物发酵生产D-阿洛酮糖是本专利技术的一个中心思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株用于发酵生产D-阿洛酮糖的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的重组菌株。本专利技术所提供的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)重组菌株的名称为SY12，该菌株已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9838。本专利技术另一目的在于提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)重组菌株SY12，保藏编号为CGMCC No. 9838。
【技术特征摘要】
1.谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)重组菌株SY12，保藏编号为CGMCCNo.9838。2.一种构建权利要求1所述谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)重组菌株SY12CGMCCNo.9838的方法，具体方法包括以下步骤：2.1构建携带L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因和果糖-1-磷酸化酶基因的载体pXFTY，具体方法为：PCR扩增来源于大肠杆菌MG1655如序列表中序列1所示的L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA)基因，如序列表中序列2所示的果糖-1-磷酸化酶(YqaB)基因、来源于pXMJ19如序列表中序列3所示的tac启动子，再以这三个基因为模板PCR扩增得到由这三个基因组成如序列表中序列4所示的融合基因FucA-tac-YqaB，然后将融合基因FucA-tac-YqaB连接入载体pXMJ19中，得到携带L-...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙媛霞，杨建刚，李季涛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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