【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体涉及一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法。
技术介绍
1、巨噬细胞不仅能穿透实体肿瘤，还能作为肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤内存活，一些实体肿瘤中tams的占比可达肿瘤总重量的50％，此外，巨噬细胞可以对趋化和细胞因子信号做出反应，靶向肿瘤，因此，目前多项临床研究正在探索巨噬细胞的药物传递潜力，但是巨噬细胞可以在实体肿瘤微环境下向肿瘤促进型(m2型)极化，加之免疫原性等原因，导致以巨噬细胞为载体的靶向药物递送系统研究受到限制。
2、外泌体是来自天然细胞的纳米级(30-100nm)囊泡，含有来自母细胞的蛋白、mrna和mi crorna等物质，外泌体已被越来越多的研究证实，是细胞通讯的重要途径，被分泌出的外泌体具有母细胞的不仅具有母细胞的部分功能并且疫原性低，且携带可以靶向远端被调控组织的靶向信号，因此，外泌体被视为一种天然的生物载体被研究使用，但是，主要依靠化学趋化性及表面化学靶向的外泌体载体的靶向效率尚不满足临床需求。
3、磁功能化外泌体的改造可以增加靶向性，众多磁性材料中，超顺磁性的氧化铁纳米颗粒fenps已在2006年被fda批准用于临床补铁剂使用，因此在建议浓度内，无生物毒性，除此之外，fenps可以在细胞溶酶体内被降解，并诱导肿瘤相关巨噬细胞(tam)从肿瘤促进型(m2型)向肿瘤抑制型(m1型)分化，m1型的巨噬细胞能够产生一系列炎症因子及活性氧族，进而激活caspase-3的活性，最终导致肿瘤细胞凋亡，因此fenps不仅可以作为一种无生物毒性的磁靶向载体材料，f
4、针对现有技术存在以下问题：
5、现有磁功能化外泌体多为先收集外泌体，再进行磁功能化改造，磁性颗粒吸附在外泌体表面，降低外泌体的天然靶向功能。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，该可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
4、步骤一：利用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7的吞噬作用内吞具有超顺磁性的氧化铁纳米颗粒fenps；
5、步骤二：共孵育24小时后，得到含有fenps的巨噬细胞，去除上清并用pbs缓冲液润洗三次，以去除黏附在细胞表面的fe2o3nps；
6、步骤三：利用去除外泌体的培养基继续培养巨噬细胞，以收集来源于已磁化的巨噬细胞外泌体，所述培养基含10％去除外泌体的胎牛血清；
7、步骤四：继续培养36小时，取细胞培养液，1200转/分钟离心5分钟，取上清，以去除细胞；
8、步骤五：取上清，5000转/分钟离心10分钟，取上清，以去除细胞碎片；
9、步骤六：利用商用外泌体提取试剂与上述上清混匀，并在4℃的环境下孵育4小时；
10、步骤七：取出孵育后的混合溶液，14000转/分钟离心30分钟，弃上清，收集沉淀，即为含fenps巨噬细胞分泌的所有外泌体；
11、步骤八：用磷酸缓冲液pbs重悬上述外泌体；
12、步骤九：在离心管一侧施加磁场，则含有fenps的外泌体被吸附在离心管壁；
13、步骤十：在磁场存在条件下，移除未被磁场吸附的pbs溶液，所得沉淀即为含有fenps的外泌体；
14、步骤十一：去掉磁场，用新鲜pbs溶液重悬被吸附到外泌体，再移除未被磁场吸附的pbs溶液，重复三次，最后用1ml的pbs溶液重悬清洗外泌体。
15、本专利技术技术方案的进一步改进在于：内磁化巨噬细胞外泌体来源于具有免疫调控功能的巨噬细胞，内含生物相容性高、可降解、可磁控以及具有肿瘤微环境调控功能的三氧化二铁纳米颗粒，兼具天然的生物靶向性和磁控物理靶向性的药物载体，可用于肿瘤靶向药物输送，为临床应用研究提供理论及实践基础。
16、本专利技术技术方案的进一步改进在于：所述磁化外泌体粒径为141nm左右，磁性纳米颗粒粒径为10nm左右。
17、本专利技术技术方案的进一步改进在于：所述磁化外泌体的磁性纳米颗粒位于外泌体内部，通过收集巨噬细胞吞噬fenps后分泌的外泌体并利用磁场纯化所得。
18、本专利技术技术方案的进一步改进在于：所述外泌体可用于装载抗肿瘤药物，并被肿瘤细胞摄入，可用于实体肿瘤的靶向药物输送及治疗。
19、本专利技术技术方案的进一步改进在于：取步骤十一中100μl的外泌体，加入戊二醛进行固定。
20、本专利技术技术方案的进一步改进在于：取80μl固定后的外泌体，并稀释至1.5m l，采用纳米颗粒跟踪分析技术nta能够检测外泌体浓度及粒径分布。
21、本专利技术技术方案的进一步改进在于：取20μl固定后的外泌体，呈水滴状滴至电镜铜网状栅中，使滴液在铜网上保留片刻，时间不低于1分钟，将2％醋酸双氧铀水溶液负染固定1-10分钟，滤纸吸干后室温自然晾干，在120kv生物透射电子显微镜下能够进行观察和拍照。
22、本专利技术技术方案的进一步改进在于：取步骤四中获得的新鲜外泌体100μl与细胞膜绿色荧光探针dio共孵育10分钟；利用超滤离心管离心dio染色外泌体，反复三次，去除未被结合的dio染料；获得的dio染色外泌体与生长在玻底培养皿上的肿瘤细胞共孵育24小时后，去除培养基，清洗，并固定，通过激光共聚焦显微镜能够对被肿瘤细胞摄入的外泌体进行观察。
23、由于采用了上述技术方案，本专利技术相对现有技术来说，取得的技术进步是：
24、1、本专利技术提供一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，本专利技术的外泌体来源于巨噬细胞，可以被实体肿瘤细胞大量摄入，可以作为抗肿瘤药物载体，靶向治疗实体瘤；本专利技术中赋予外泌体磁靶向的超顺磁性fenps位于外泌体内部，可以更完整的保留巨噬细胞外泌体天然的趋化信号和生物靶向性，提高载药系统的生物相容性，有效躲避网状内皮系统的清除，进而提高肿瘤细胞对磁功能化外泌体的识别及摄入，增强肿瘤靶向治疗效果。
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1.一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：该可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：内磁化巨噬细胞外泌体来源于具有免疫调控功能的巨噬细胞，内含生物相容性高、可降解、可磁控以及具有肿瘤微环境调控功能的三氧化二铁纳米颗粒，兼具天然的生物靶向性和磁控物理靶向性的药物载体，可用于肿瘤靶向药物输送，为临床应用研究提供理论及实践基础。
3.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述磁化外泌体粒径为141nm左右，磁性纳米颗粒粒径为10nm左右。
4.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述磁化外泌体的磁性纳米颗粒位于外泌体内部，通过收集巨噬细胞吞噬FeNPs后分泌的外泌体并利用磁场纯化所得。
5.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体可用于装载抗肿瘤药物，并被肿瘤细胞摄入，可
6.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：取步骤十一中100μl的外泌体，加入戊二醛进行固定。
7.根据权利要求6所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：取80μl固定后的外泌体，并稀释至1.5ml，采用纳米颗粒跟踪分析技术NTA能够检测外泌体浓度及粒径分布。
8.根据权利要求6所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：取20μl固定后的外泌体，呈水滴状滴至电镜铜网状栅中，使滴液在铜网上保留片刻，时间不低于1分钟，将2％醋酸双氧铀水溶液负染固定1-10分钟，滤纸吸干后室温自然晾干，在120kv生物透射电子显微镜下能够进行观察和拍照。
9.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：取步骤四中获得的新鲜外泌体100μl与细胞膜绿色荧光探针DiO共孵育10分钟；利用超滤离心管离心DiO染色外泌体，反复三次，去除未被结合的DiO染料；获得的DiO染色外泌体与生长在玻底培养皿上的肿瘤细胞共孵育24小时后，去除培养基，清洗，并固定，通过激光共聚焦显微镜能够对被肿瘤细胞摄入的外泌体进行观察。
...【技术特征摘要】
1.一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：该可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：内磁化巨噬细胞外泌体来源于具有免疫调控功能的巨噬细胞，内含生物相容性高、可降解、可磁控以及具有肿瘤微环境调控功能的三氧化二铁纳米颗粒，兼具天然的生物靶向性和磁控物理靶向性的药物载体，可用于肿瘤靶向药物输送，为临床应用研究提供理论及实践基础。
3.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述磁化外泌体粒径为141nm左右，磁性纳米颗粒粒径为10nm左右。
4.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述磁化外泌体的磁性纳米颗粒位于外泌体内部，通过收集巨噬细胞吞噬fenps后分泌的外泌体并利用磁场纯化所得。
5.根据权利要求1所述的一种可靶向肿瘤细胞的磁化巨噬细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体可用于装载抗肿瘤药物，并被肿瘤细胞摄入，可用于实体肿瘤的靶向药物输送及治疗。
6.根据权利...
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