一株多孔木霉菌株及其制备萜类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一株多孔木霉(Tolypocladium inflatum)菌株P086，已于2016年11月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.13191。

【技术实现步骤摘要】
一株多孔木霉菌株及其制备萜类化合物的方法
本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及萜类菌种发酵

技术介绍
从真菌分离的活性天然产物属于萜类化合物(terpestacin)，萜类化合物(terpestacin)碳骨架为一个十五元环和一个五元环稠合而成的双环骨架，其中，十五元环上有三个反式三取代双键，同时具有四个手性中心，其中包括一个季碳手性中心，而五元环为官能团密集的1,2-双酮结构，其中一个羰基呈现烯醇式结构。其分子结构式为：萜类化合物(terpestacin)具有温和的抗菌活性，并具有良好的生物选择活性，因而作为一种非常有前景的药物受到广泛的关注。但是现有制备萜类化合物的方法生产周期长，效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086。多孔木霉菌株的分离多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)，是本实验室从冬虫夏草子实体中分离而得，属于真菌界双核亚界(Dikarya)子囊菌门(Ascomycota)子囊菌亚门(Pezizomycotina)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草科(Ophiocordycipitaceae)弯颈霉属(Tolypocladium)。本专利技术的多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086，已于2016年11月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.13191。本专利技术的多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086的鉴定中的ITS序列测序所使用引物为：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’及ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，PCR结果为见图1。本专利技术还提供了利用多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)制备萜类化合物的方法及萜类化合物对巨噬细胞释放NO的抑制作用及细胞毒性。利用多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)制备萜类化合物(terpestacin)的方法，包括以下步骤：(1)将活化的多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)接种到固体培养基上进行发酵培养。(2)在步骤1)发酵后，向培养物加入有机溶剂提取，得到提取液，将所述提取液减压蒸馏，得到粗提物和子馏分。优选的，所述的固体培养基为大米培养基。优选的，所述的发酵培养的条件是18-28℃，静止培养20-60天。优选的，所述的有机溶剂是乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、异丙醇和正丁醇等。优选的，所述的方法中，还包括将所述粗提物和子馏分进行正向硅胶柱层层析或凝胶柱层析分离得到萜类化合物。优选的，所述的层析，以石油醚-二氯甲烷(比例为100：0、100：1、100：2、100：3、20：1、10：1、8：1、5:1、4：1、3：1、2：1、1：1、0：1v/v)或二氯甲烷-甲醇(比例为100：0、100：1、100：2、100：3、20：1、10：1、8：1、5:1、4：1、3：1、2：1、1：1、0：1v/v))为流动相梯度洗脱；反向硅胶柱色谱分离,以甲醇-水(比例为5：95、10：90、15：85、20：80、25：75、30：70、35：65、40：60、45：55、50：50、55：45、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10、95：5、100：0v/v)为流动相梯度洗脱；凝胶柱层析则选用甲醇为流动相洗脱。子馏分经正相、反相硅胶柱层析，馏分减压浓缩干燥后溶解于甲醇溶液中，室温静置，得到各馏分样品。在经过制备型高效液相等现代天然药物化学提取分离手段得到纯净的萜类化合物。优选的，所述步骤1)中，还包括在固体发酵之前将多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)在固体培养基上进行预培养，取预培养后的菌丝体转接到液体培养基中进行活化培养或接种于若干固体培养基上进行活化；培养的条件均为：25℃，培养7天。本专利菌株生长迅速，且生产萜类化合物效率很高；本专利菌株在PDB培养基上进行液体发酵72小时即可产出萜类化合物，而在大米培养基上进行固体发酵时7天即可产出萜类化合物；另外，本专利菌株产出萜类化合物总量占次级代谢产物粗提物的0.5％(10g粗提物纯化出50mg萜类化合物)，产率非常高。附图说明图1多孔木霉菌株(菌株名)鉴定图。图2萜类化合物的1H-NMR(CDCl3)谱图。图3萜类化合物的1H-NMR(Acetone-d6)谱图。图4萜类化合物的13C-NMR(Acetone-d6)谱图。具体实施方式下面用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)获得(1)菌株分离在从冬虫夏草子实体中分离得到的一株真菌内生菌多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)。具体分离方法是，首先，用消毒酒精对冬虫夏草子实体进行表面消毒(75％酒精30s，5％NaClO90s)并用无菌水漂洗置于灭菌滤纸上干燥，切成小块后接种于PDA平板上培养分离纯化菌株(2)多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)鉴定使用艾德莱生物科技有限公司产品真菌基因组DNA快速提取试剂盒，对菌株进行DNA提取，利用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’及ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对其DNA进行PCR，送于北京擎科新业生物技术有限公司测序，其ITS序列如图1所示。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)将序列进行核酸BLAST将菌株鉴定为多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)。多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)已于2016年11月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNO.13191。实施例2多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)发酵制备萜类化合物(1)菌株活化、发酵培养将多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086(CGMCCNO.13191)从低温冰箱、液氮储罐或其它保藏条件下取出，挑选菌丝接种到PDA培养基的斜面或平板上，进行预培养；预培养的条件为：25℃培养3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株多孔木霉(Tolypocladium inflatum)菌株P086 CGMCC NO.13191。

【技术特征摘要】
1.一株多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086CGMCCNO.13191。2.一种多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)菌株P086制备萜类化合物的方法，其特征在于：(1)将活化的多孔木霉菌株P086接种到固体培养基上进行发酵培养；(2)向培养物加入有机溶剂提取，得到提取液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的固体培养基为大米培养基。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养，温度为18-28℃，静止培养20-60天。5.根据权利要求2所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李二伟，张蕴之，刘杏忠，任晋玮，王文昭，裴云飞，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11