一种从冬虫夏草寄主体液中分离纯化冬虫夏草菌的方法及检测液相芯片技术

本发明专利技术提供了一种从冬虫夏草寄主体液中分离冬虫夏草菌体的方法，包括以下步骤：将被冬虫夏草菌侵染的寄主昆虫血淋巴通过密度梯度离心分级分离；将冬虫夏草菌体粗提物利用超纯水裂解除去未被分离的血细胞，通过蛋白酶K去除冬虫夏草菌体粗提物冗余蛋白质；利用核酸酶降解残余寄主昆虫的DNA及RNA，分离获得纯化后的冬虫夏草虫菌体；验证获得的冬虫夏草虫菌体是否存在寄主昆虫核酸的污染；将未污染的冬虫夏草虫菌体作为最终产物；该方法填补了从活体寄主昆虫体内获得实时侵染态菌体研究领域的空白。

【技术实现步骤摘要】
一种从冬虫夏草寄主体液中分离纯化冬虫夏草菌的方法及检测液相芯片
专利技术涉及一种菌体提取方法，更加具体的说涉及一种从冬虫夏草寄主昆虫体液中分离冬虫夏草菌的方法及其检测液相芯片。技术背景目前对于冬虫夏草菌致病基因研究以及冬虫夏草菌侵染寄主昆虫过程中虫菌互作机制等研究几乎处于空白状态。主要原因在于，活体状态下，很难获得侵染态菌体。冬虫夏草菌生长周期长，与一般的虫生真菌侵染模式不同，所以利用冬虫夏草菌株，离体条件下获得EST序列分析冬虫夏草菌侵入寄主昆虫过程中基因的表达情况尚无法实现。冬虫夏草菌侵染寄主昆虫后，如何从寄主昆虫血淋巴中分离纯化到无寄主血细胞、蛋白质以及DNA、RNA污染的冬虫夏草菌，是有效提取无污染的冬虫夏草菌DNA/RNA、构建DNA/RNA文库、分析冬虫夏草菌侵染寄主后基因表达谱变化等方面的关键技术。从寄主昆虫体内直接获取实时状态的虫草菌菌体，分析其侵染寄主昆虫的致病分子机理机制，对于了解真菌-昆虫互作机制，研究冬虫夏草菌侵染寄主昆虫的科学内涵具有十分重要的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种从冬虫夏草寄主体液中分离冬虫夏草菌体的方法，包括以下步骤：1)将被冬虫夏草菌侵染的寄主昆虫血淋巴通过密度梯度离心分级分离，得到冬虫夏草菌体粗提物；2)将冬虫夏草菌体粗提物利用超纯水裂解除去未被分离的血细胞，通过蛋白酶K去除冬虫夏草菌体粗提物冗余蛋白质；3)利用核酸酶降解残余寄主昆虫的DNA及RNA，分离获得纯化后的冬虫夏草虫菌体；4)从纯化后的冬虫夏草虫菌体中提取DNA和RNA，设计冬虫夏草寄主昆虫特异性引物进行PCR(聚合酶链反应)以及RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)，验证获得的冬虫夏草虫菌体是否存在寄主昆虫核酸的污染；将未污染的冬虫夏草虫菌体作为最终产物。2.根据权利要求1所述的从冬虫夏草寄主昆虫体液中分离冬虫夏草菌体的方法，其特征在于：步骤1)所述密度梯度分级分离为：1)在超速离心管中从底部往上依次加入寄主昆虫血淋巴5倍体积的浓度为55％的Centricoll分离液、浓度为45％的Centricoll分离液、浓度为35％的Centricoll分离液、浓度为25％的Centricoll分离液；2)在超速离心管中加入寄主昆虫的血淋巴，使寄主昆虫的血淋巴位于25％的Centricoll分离液上方；3)4℃、10000g条件下离心10-15min，去除上清液，获得底部沉淀物，得到冬虫夏草菌体粗提物。3.根据权利要求1所述的从寄主体液中分离冬虫夏草菌体的方法，其特征在于：所述冬虫夏草寄主昆虫为蝠蛾属、钩蝠蛾属、无钩蝠蛾属或拟蝠蛾属的幼虫。一种检测液相芯片，用于检测从冬虫夏草寄主昆虫体液中分离到的虫菌体，是否受到寄主昆虫核酸污染；针对冬虫夏草寄主昆虫18SrDNA，设计扩增引物为：18sF：5'-CGAAACTGCGAATGGCTCA-3'和18sR：5'-CCGAAGTCGGGATTTTTAGC-3'。本专利技术的有益技术效果是：本专利技术提供了一种从冬虫夏草寄主昆虫体液中提取冬虫夏草菌体的方法，该方法填补了从活体寄主昆虫体内获得实时侵染态菌体研究领域的空白。本专利技术提供的冬虫夏草菌体检测液相芯片在判断冬虫夏草菌体纯度方面，相较其它方法具有灵敏度高，准确性好的特点。附图说明图1未经纯化的虫菌体镜检图；图2纯化后虫菌体镜检图；图3纯化前后虫菌体昆虫核酸污染检测(1.未经纯化的菌体组有明显的核酸污染；2.纯化后的菌体组无核酸污染)。具体实施方式实施例1冬虫夏草菌体的制备1.在超速离心管中从底部往上依次加入寄主昆虫血淋巴35ml的浓度为55％的Centricoll分离液、浓度为45％的Centricoll分离液、浓度为35％的Centricoll分离液、浓度为25％的Centricoll分离液；2.从被冬虫夏草菌侵染的冬虫夏草寄主昆虫体内提取血淋巴7ml。在超速离心管中加入血淋巴；3.在4℃、离心力10000g条件下离心15min，除去上层液体，吸取底部沉淀物，即为冬虫夏草菌体粗提物；4.将冬虫夏草菌体粗提物利用超纯水裂解除去残留的血细胞，加入5～10倍沉淀物体积的超纯水裂解，离心2～5分钟；去除上清液；5.通过蛋白酶K去除冬虫夏草菌体粗提物冗余蛋白质；6.再加入脱氧核糖核酸酶以及核糖核酸酶，充分混匀后15～18℃处理5小时；离心3分钟，弃除上清液，超纯水洗涤沉淀2次，获得冬虫夏草菌体提取物约100mg，其中未分离前的纯化前如图1所示，经过纯化后如图2所示。实施例2冬虫夏草菌体纯度的鉴定所述检测从寄主昆虫体液中分离的冬虫夏草菌体的液相芯片包括针对冬虫夏草寄主昆虫18SrDNA基因部分片段，设计能够扩增出目标序列的引物对(见表1)。表118SrDNA基因扩增引物SEQNO.类型扩增引物(5’-3’)1ForwardCGAAACTGCGAATGGCTCA2ReverseCCGAAGTCGGGATTTTTAGC所有引物序列由重庆市中药研究院冬虫夏草研究所研究获得。合成后的每条引物分别用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。取少许冬虫夏草菌沉淀提取DNA和RNA，用上述液相芯片进行PCR以及RT-PCR反应，验证虫菌体沉淀中是否存在寄主昆虫DNA或者RNA污染(具体如图3所示)。该方法具有灵敏度高、准确性好的特点。SEQUENCELISTING<110>重庆市中药研究院<120>一种从寄主血淋巴中分离冬虫夏草菌体的方法及其检测液相芯片<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>保守区域引物人工序列<400>1cgaaactgcgaatggctca19<210>2<211>20<212>DNA<213>保守区域引物人工序列<400>2ccgaagtcgggatttttagc20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从冬虫夏草寄主体液中分离冬虫夏草菌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将被冬虫夏草菌侵染的寄主昆虫血淋巴通过密度梯度离心分级分离，得到冬虫夏草菌体粗提物；2）将冬虫夏草菌体粗提物利用超纯水裂解除去未被分离的血细胞，通过蛋白酶K去除冬虫夏草菌体粗提物冗余蛋白质；3）利用核酸酶降解残余寄主昆虫的DNA及RNA，分离获得纯化后的冬虫夏草虫菌体；4）从纯化后的冬虫夏草虫菌体中提取DNA和RNA，设计冬虫夏草寄主昆虫特异性引物进行PCR以及RT‑PCR，验证获得的冬虫夏草虫菌体是否存在寄主昆虫核酸的污染；将未污染的冬虫夏草虫菌体作为最终产物。

【技术特征摘要】
1.一种从冬虫夏草寄主体液中分离冬虫夏草菌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将被冬虫夏草菌侵染的寄主昆虫血淋巴通过密度梯度离心分级分离，得到冬虫夏草菌体粗提物；2）将冬虫夏草菌体粗提物利用超纯水裂解除去未被分离的血细胞，通过蛋白酶K去除冬虫夏草菌体粗提物冗余蛋白质；3）利用核酸酶降解残余寄主昆虫的DNA及RNA，分离获得纯化后的冬虫夏草虫菌体；4）从纯化后的冬虫夏草虫菌体中提取DNA和RNA，设计冬虫夏草寄主昆虫特异性引物进行PCR以及RT-PCR，验证获得的冬虫夏草虫菌体是否存在寄主昆虫核酸的污染；将未污染的冬虫夏草虫菌体作为最终产物。2.根据权利要求1所述的从冬虫夏草寄主昆虫体液中分离冬虫夏草菌体的方法，其特征在于：步骤1）所述密度梯度分级分离为：1）在超速离心管中从底部往上依次加入寄主昆虫血淋巴5倍体积的浓度为55%的Centricoll分...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁增辉，石萍，陈仕江，张德利，贺元川，贺宗毅，涂永勤，邢康康，游华健，
申请(专利权)人：重庆市中药研究院，
类型：发明
国别省市：重庆,50