一种高纯度D‑阿洛酮糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高纯度D‑阿洛酮糖的制备方法，步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌的发酵液经离心后，取菌体经均质处理，得到含有D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的混合液；(2)配制果糖溶液，加入含有D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的混合液，调pH值，保温反应，然后向反应液中流加果糖溶液，继续反应，停止反应，制得D‑阿洛酮糖粗液；(3)将D‑阿洛酮糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩后，再经过结晶或干燥，制得D‑阿洛酮糖。本发明专利技术采用枯草芽孢杆菌发酵液直接生产，省去了提取酶的过程，使生产成本大大降低，较传统生产方法降低成本达25％左右，使产品的竞争力大大增强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法，属于生物

技术介绍
D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。D-阿洛酮糖可通过提高细胞内谷胱甘肽水平，起到保护神经的作用，降血糖、减脂、改善产品品质、较高的抗氧化功能；作为甜味剂，D-阿洛酮糖甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，对生长小鼠几乎不产生能量，没有毒性；与果糖和果糖相比，D-阿洛酮糖能抑制小鼠肝脏脂肪合成酶活性，减少腹脂积累，可以作为一种甜味剂在辅助减肥中使用；D-阿洛酮糖显示出较强的清除活性氧簇的功能，使其在多种疾病预防和治疗中显示出潜在的医疗价值。中国专利文献CN105602879A(申请号201610051547.3)公开了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。该专利技术通过利用由瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe构建重组表达质粒pMA5-RDPE，然后转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子PxylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0％降低为0.5％。最终，采用分批补料方式，在7.5L发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95U/mL和2.6g/L。但该酶的酶活仍然较低，无法满足实际生产的需要。但目前D-阿洛酮糖存在转化率低、易分解等问题，这样大大限制了D-阿洛酮糖的应用领域，产品本身特性难以有效发挥。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高纯度D-阿洛酮糖的制备方法。本专利技术技术方案如下：一种D-阿洛酮糖的制备方法，步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌的发酵液经离心后，取菌体经均质处理，得到含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005，于2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；(2)配制质量浓度为20％～60％的果糖溶液，加入含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液，调pH值5.5～6.5，按质量百分比0.001％～0.005％的比例添加氯化钴，在40～60℃条件下，保温反应10～30小时，然后向反应液中流加果糖溶液，维持反应体系中果糖质量浓度为20％～60％，继续反应10～30h，停止反应，制得D-阿洛酮糖粗液；(3)将步骤(2)制得的D-阿洛酮糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩后，再经过结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，离心条件为：温度10～20℃，转速3000r/min，时间30～50分钟。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，均质的条件为：温度10～20℃，压力30mpa～50mpa，时间10～20min。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌的发酵液的制备方法如下：I、将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养6～12h，制得种子液；所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.0～7.0；II、将步骤I制得的种子液按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃发酵培养30～48h，制得枯草芽孢杆菌发酵液；所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH6.0～7.0。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液的加入量为果糖溶液体积百分比的5％。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，脱色步骤如下：将步骤(2)制得的D-阿洛酮糖粗液，按质量百分比0.5～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，离交步骤如下：将脱色过滤后的粗糖液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，色谱分离步骤如下：色谱运行压力0.20～0.30MPa，温度60～70℃，水耗比1∶(1.3～1.6)，每小时进料1.5～2.0m3，收集D-阿洛酮糖。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06-0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75％。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，结晶反应条件为：糖液质量浓度70～85％，温度50～70℃，添加溶质质量10～30％的晶种，搅拌均匀，于50～70℃静置8～16小时，随后按照3～6h降1℃的速率缓慢降温，同时缓慢搅拌，直至溶液中形成大量均匀、规则的晶粒，分离，制得D-阿洛酮糖。有益效果1、本专利技术从土壤中分离出枯草芽孢杆菌，在经过紫外诱变、亚硝基胍诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产D-阿洛酮糖差向异构酶的高产菌株命名为BLCY-005，其酶活达到143U/ml，较传统D-阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，大大提高了蔗糖转化成D-阿洛酮糖的能力，同时采用流加果糖的方法，使终产品中D-阿洛酮糖含量达到99％，显著优于现有制备获得的产品，显著降低生产成本，最适pH值为5.5～6.5，与传统菌株产D-阿洛酮糖差向异构酶最适pH偏中性相比，有利于生产中对污染的控制。2、本专利技术采用枯草芽孢杆菌发酵液直接生产，省去了提取酶的过程，使生产成本大大降低，较传统生产方法降低成本达25％左右，使产品的竞争力大大增强；3、本专利技术由于采用显著高于现有酶活的D-阿洛酮糖差向异构酶，通过调整工艺步骤和参数，制得了高纯度的D-阿洛酮糖，D-阿洛酮糖作为低热量甜味剂，可广泛应用于食品饮料、化妆品、医药等领域，实现了D-阿洛酮糖大规模工业生产，显著降低了生产成本，扩大了D-阿洛酮糖的应用范围。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种D‑阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌的发酵液经离心后，取菌体经均质处理，得到含有D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的混合液；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY‑005，于2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；(2)配制质量浓度为20％～60％的果糖溶液，加入含有D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的混合液，调pH值5.5～6.5，按质量百分比0.001％～0.005％的比例添加氯化钴，在40～60℃条件下，保温反应10～30小时，然后向反应液中流加果糖溶液，维持反应体系中果糖质量浓度为20％～60％，继续反应10～30h，停止反应，制得D‑阿洛酮糖粗液；(3)将步骤(2)制得的D‑阿洛酮糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩后，再经过结晶或干燥，制得D‑阿洛酮糖。

【技术特征摘要】
1.一种D-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌的发酵液经离心后，取菌体经均质处理，得到含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005，于2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；(2)配制质量浓度为20％～60％的果糖溶液，加入含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶的混合液，调pH值5.5～6.5，按质量百分比0.001％～0.005％的比例添加氯化钴，在40～60℃条件下，保温反应10～30小时，然后向反应液中流加果糖溶液，维持反应体系中果糖质量浓度为20％～60％，继续反应10～30h，停止反应，制得D-阿洛酮糖粗液；(3)将步骤(2)制得的D-阿洛酮糖粗液经脱色、过滤、离交、色谱分离、浓缩后，再经过结晶或干燥，制得D-阿洛酮糖。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，离心条件为：温度10～20℃，转速3000r/min，时间30～50分钟。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，均质的条件为：温度10～20℃，压力30mpa～50mpa，时间10～20min。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，枯草芽孢杆菌的发酵液的制备方法如下：I、将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BLCY-005接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养6～12h，制得种子液；所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.0～7.0；II、将步骤I制得的种子液按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃发酵培养30～48h，制得枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明站，干昭波，窦光鹏，邵先豹，郝梅，杜倩，杨腾腾，
申请(专利权)人：山东百龙创园生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37