用于分泌产生蛋白质的方法技术

本发明专利技术开发一种用于提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力的新技术，提供分泌产生多聚体蛋白质的方法。使用具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达的棒状杆菌型细菌作为表达宿主，分泌生产多聚体蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术开发一种用于提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力的新技术，提供分泌产生多聚体蛋白质的方法。使用具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达的棒状杆菌型细菌作为表达宿主，分泌生产多聚体蛋白质。【专利说明】
本专利技术涉及高效分泌产生异源蛋白质的棒状杆菌型细菌，和用于分泌产生异源蛋白质的方法。具体地，根据本专利技术分泌产生的异源蛋白质是多聚体蛋白质。
技术介绍
关于用微生物分泌产生异源蛋白质，迄今为止已经报道了利用芽孢杆菌属细菌(Bacillus bacterium)(非专利文件 I)、甲醇同化酵母(methanol-assimilating yeast)、巴斯德毕赤酵母(非专利文件2)、曲霉菌属的丝状真菌(非专利文件3和4)等分泌产生异源蛋白质。也有人尝试用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质。关于用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质，已经有报道用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,下文也缩写为C.glutamicum)分泌核酸酶和酯酶(专利文件1、非专利文件5),分泌蛋白质酶如枯草杆菌蛋白质酶(非专利文件6)，利用棒状杆菌型细菌细胞表层蛋白质PSl和PS2(也称作CspB)的信号肽来分泌蛋白质(专利文件2)，使用PS2 (CspB)的信号肽来分泌纤连蛋白结合蛋白质(非专利文件7)，利用棒状杆菌型细菌的细胞表层蛋白质PS2 (CspB)和SlpA(也称作CspA)的信号肽来分泌转谷氨酰胺酶原(protransglutaminase)(专利文件3),使用变异体型分泌系统分泌蛋白质(专利文件4)，用变异体菌株分泌转谷氨酰胺酶原(专利文件5)，利用Tat依赖性信号肽来分泌蛋白质(专利文件6)等。有多种蛋白质被考虑作为用来分泌产生的蛋白质。然而，关于用棒状杆菌型细菌分泌产生异源蛋白质，尚 未有任何由多个亚单位构成的多聚体蛋白质(例如抗体相关分子)的分泌产生的报道。金属肽酶是蛋白酶的一类，其需要诸如锌离子和钙离子这样的金属离子来对其进行激活，并具有分解多种类型蛋白质的活性。在这些金属肽酶中，属于M23/M37家族的金属肽酶(也称作M23/M37金属肽酶)是需要锌离子的金属内肽酶。基于序列信息已经知道谷氨酸棒状杆菌的Cgl0858基因是编码包括与M23/M37金属肽酶基序同源的区域的蛋白质的基因。但是，在谷氨酸棒状杆菌中Cgl0858基因编码的蛋白质的功能仍是未知的。另外，没有发现涉及对于任何生物物种，由于高表达编码包含与该M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质的基因会使得目标异源蛋白质的表达量提高。青霉素结合蛋白质(PBP)是与内酰胺型抗生素结合的蛋白质的总称，与β-内酰胺型抗生素的结合抑制它们的酶功能。PBP—般是膜结合蛋白质，它们被认为对细菌细胞壁的合成是必不可少的。PBP根据其分子量分为高分子量PBP (HMW-PBP)和低分子量PBP (LMW-PBP)。其中，HMW-PBP进一步分为A类高分子量PBP (Α类HMW-PBP)和B类高分子量PBP (B类HMW-PBP)。A类HMW-PBP具备具有交联肽聚糖部分的转肽酶活性的转肽酶活性域，和具有从二糖从二糖形成多糖链的转糖基酶活性的转糖基酶活性域；而B类HMW-PBP仅具有转肽酶活性域。关于谷氨酸棒状杆菌的PBP的发现在非专利文件8、9等中有详细描述。在谷氨酸棒状杆菌中，迄今为止至少发现了 9种PBP同源物。其中5种是HMW-PBP，包括两种A类HMW-PBP (PBPla、PBPlb)和三种 B 类 HMW-PBP (Fst1、PBP2a、PBP2b)。已知谷氨酸棒状杆菌的A类HMW-PBP是负责细胞伸展的因子，B类HMW-PBP是在细胞分裂时负责形成隔膜壁的肽聚糖的因子。但是，青霉素结合蛋白和异源蛋白质的分泌产生之间的关系尚不清楚。现有技术参考文献专利文件 专利文件1:美国专利N0.4，965，197专利文件2:日本专利特表平6-502548专利文件3:日本专利4320769专利文件4:日本专利申请特开平11-169182专利文件5:日本专利4362651专利文件6:日本专利4730302非专利文件非专利文件l:Microbiol.rev.，57，109-137 (1993)非专利文件2:Biotechnol.，11，905-910 (1993)非专利文件3:Biotechnol.，6，1419-1422 (1988)非专利文件4:Biotechnol.，9，976-981 (1991)非专利文件5: J.Bacteriol.，174，1854-1861 (1992)非专利文件6: Appl.Environ.Microbiol., 61,1610-1613 (1995)非专利文件7: Appl.Environ.Microbiol., 63,4392-4400 (1997)非专利文件8:Mol.Microbiol.，66，643-57 (2007)非专利文件9: Antonie Van Leeuwenhoek, 94,99-109 (2008)
技术实现思路
本专利技术要实现的目的本专利技术的一个目标是开发一种用于提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力的新技术，由此提供分泌产生多聚体蛋白质的棒状杆菌型细菌，和使用这种细菌分泌产生多聚体蛋白质的方法。实现目标的手段本专利技术人为实现前述目标进行了多方研究，结果他们发现，在利用棒状杆菌型细菌作为表达宿主产生异源蛋白质的方法中，通过修饰棒状杆菌型细菌而增加其编码金属肽酶的基因的表达可以提高棒状杆菌型细菌分泌产生多聚体蛋白质的能力，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及如下:1.一种棒状杆菌型细菌，其具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达。2.根据权利要求1的棒状杆菌型细菌，其中，所述基因的表达是通过增加该基因的拷贝数或修饰该基因的表达调控序列而提闻的。3.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中，所述金属肽酶是M23/M37金属肽酶或包含与M23/M37金属肽酶的基序同源的区域的蛋白质。4.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中，所述金属肽酶是下面(A)或(B)中所示的蛋白质:(A)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸的蛋白质，(B)具有包括I~10个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，并且具有如下性质的蛋白质:当该蛋白质在棒状杆菌型细菌中的表达得到了提高时，多聚体蛋白质的分泌生产量相比于非修饰菌株中观察到的分泌生产量增加。5.如上所述的棒状杆菌型细菌，其还经过修饰而降低了青霉素结合蛋白的活性。6.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中降低了细胞表层蛋白的活性。7.如上所述的棒状杆菌型细菌,其属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。 8.如上所述的棒状杆菌型细菌，其是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。9.如上所述的棒状杆菌型细菌，其中，所述棒状杆菌型细菌具有用于分泌表达所述多聚体蛋白质的基因构建体，以及其中，所述基因构建体包括:在所述棒状杆菌型细菌中发挥功能的启动子序列，连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种棒状杆菌型细菌，其具有分泌产生多聚体蛋白质的能力，并且经过修饰而提高了编码金属肽酶的基因的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：松田吉彦，别府春树，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP