本发明专利技术的目的是改善宿主细胞的蛋白质分泌以增加发酵过程中的蛋白质产量。这是通过表达载体实现的，所述表达载体包含a)启动子序列和b)编码蛋白质的核酸序列。蛋白质包含信号肽和额外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ?ID?NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，与SEQ?ID?NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ?ID?NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与所述序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善的蛋白质分泌的表达载体本专利技术属于生物技术的领域，更特别是微生物蛋白质合成的领域。本专利技术尤其涉及用于制备蛋白质的表达载体，并另外提出了包含此类表达载体的宿主细胞。本专利技术还涉及此类表达载体和宿主细胞用于蛋白质制备的方法和用途。为了制备蛋白质，可以利用表达目标蛋白的基因的宿主细胞，更特别是微生物。一般以使其表达的方式将目标蛋白的基因(转基因)导入到宿主细胞中。常见的是其与一个或多个允许基因表达的启动子序列(启动子)共同存在于所谓的表达载体上。为了工业规模的生物技术生产，在发酵罐中培养所讨论的宿主细胞，根据细胞的代谢特性调整发酵罐。在培养过程中，宿主细胞代谢所供应的底物，并形成理想的产物，所述产物在发酵结束后通常与生产生物分离，并从发酵罐浆和/或发酵基质中纯化和/或浓缩。固有地在发酵中获得非常高的产量是理想的。产量依赖于多种因素，例如除实际需要的产物外，宿主细胞通常形成多种一般非目的性的其他物质。此外，转基因的表达及产物的产量基本上取决于所使用的表达系统。例如，国际专利申请W091 / 02792公开了在优化的地衣芽孢杆菌中，在来自地衣芽孢杆菌的基团调控序列的控制下，更特别是地衣芽孢杆菌的启动子的控制下，来自迟缓芽孢杆菌的碱性蛋白酶的改善的发酵生产。为了工业生产蛋白质，例如水解酶，优选使用能够将大量蛋白质分泌到培养上清中的宿主细胞，使得不必进行复 杂的细胞破碎，所述复杂的细胞破碎对于胞内生产是必需的。出于该目的，优选使用这样的宿主细胞，例如芽孢杆菌属物种，其可以在有效的高细胞密度发酵方法中使用有成本效益的培养基培养，并能够将大量克/升的靶蛋白质分泌到培养上清中。通常，由表达载体表达待分泌的蛋白质，所述表达载体已经被导入到宿主细胞中并且编码待分泌的蛋白质。经表达的蛋白质通常包含使其从宿主细胞输出的信号肽(信号序列)。信号肽通常是在宿主细胞中翻译的多肽链的一部分，但其还可以在宿主细胞内或外，从蛋白质上翻译后切割掉。尤其是对于异源蛋白质的胞外生产，然而存在多种瓶颈，并且相应的非常需要优化分泌过程。瓶颈之一是选择允许靶蛋白从宿主细胞有效输出的信号肽。原则上，信号肽可以是与蛋白质，更特别是与酶新组合的。例如Brockmeier等人的出版物(J.Mol.Biol.362,第393-402页(2006))描述了使用角质酶的实例分泌信号肽文库的策略。然而，不是每个信号肽也在发酵条件下，更特别是在工业或工业规模的发酵条件下，带来充足的蛋白质输出。因此，本专利技术的目标是改善宿主细胞的蛋白质分泌，以及结果为增加发酵方法中的蛋白质产量。本专利技术提供了表达载体，包含a)启动子序列，和b)编码蛋白质的核酸序列，蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，信号肽包含与SEQ ID N0.2中说明的氨基酸序列至少80%相同，或与SEQ ID N0.4中说明的氨基酸序列至少80%相同，或与SEQ ID N0.6中说明的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。令人惊讶地发现，编码具有此类信号肽的蛋白质的表达载体实现了含有表达载体并且表达核酸序列b)的宿主细胞的改善的蛋白质分泌。结果是在本专利技术的优选的实施方案中，能够增加发酵方法中的蛋白质产量。表达载体是使得蛋白质能够在宿主细胞中，更特别在微生物中表达的核酸序列。其包含遗传信息，即，编码蛋白质的核酸序列(基因)b)。核酸序列的表达是成为所述序列编码的基因产物，即，成为多肽(蛋白质)或成为多个多肽(蛋白质)。术语多肽和蛋白质在本申请中是同义使用的。出于本专利技术的目的，表达因此意味着从遗传信息生物合成核糖核酸(RNA)和蛋白质。一般而言，表达包含转录，即，基于基因的DNA (脱氧核糖核酸)序列合成信使核糖核酸(mRNA)，和将mRNA翻译成相应的多肽链，所述多肽链还可以被翻译后修饰。因此，蛋白质的表达描述了从遗传信息生物合成蛋白质，根据本专利技术在表达载体上提供所述遗传信息。载体是由核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)组成的遗传元件，是生物
的技术人员已知的。特别地当在细菌中使用时，载体是特定的质粒，即，环状遗传元件。例如，载体可以包括源自细菌质粒、病毒或噬菌体的载体，或者含有非常多样来源的元件、主要是合成的载体或质粒。有了各种情况下存在的其他遗传元件，载体能够使其在优选通过转化导入的宿主细胞中建系作为稳定的单元存在多代。在这一方面，载体是作为独立单元在染色体外建系，还是整合到染色体或染色体DNA中，对于本专利技术的目的而言都是不重要的。根据个案在多种系统中选择。关键性因素可以是例如可实现的拷贝数、可利用的选择体系，尤其包括抗生素抗性，或能够摄入载体的宿主细胞的可培养性。表达载体还可以是随培养条件的改变(例如细胞密度或添加特定化合物)而可调控的。此类化合物的实例是半乳糖衍生的异丙基_β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，其用作细菌乳糖操纵子(lac操纵子)的激活剂。表达载体还包含至少一个核酸序列，优选DNA，所述核酸序列对编码蛋白质的核酸序列b)的表达具有控制功能(所谓的基因调控序列)。在此情况下，基因调控序列是任何这样的核酸序列，所述核酸序列通过其在特别的宿主细胞中的存在，影响，优选增加编码蛋白质的核酸序列b)的转录速率。优选地，其是启动子序列，因为此类序列对于核酸序列b)的表达是必需的。然而，根据本专利技术的表达载体还可以包含其他基因调控序列，例如一个或多个增强子序列。因此，用于本专利技术目的的表达载体包含至少一个由核酸序列b)和启动子(表达盒)构成的功能单元。其可以，但不必作为物理实体存在。启动子使核酸序列b)在宿主细胞中表达。出于本专利技术的目的，表达载体还可以限制为由启动子和待表达的核酸序列b)构成的纯表达盒，所述表达盒可以整合在染色体外或染色体上。根据本专利技术的此类表达载体的实施方案各自构成了本专利技术的独立实施方案。因此，存在至少一 个启动子对根据本专利技术的表达载体是必需的。因此，启动子被理解为意指允许基因的受调控的表达的DNA序列。启动子序列天然地是基因的组分，并且通常位于基因的5’端，并因此位于RNA编码区之前。优选地，根据本专利技术的表达载体中的启动子序列位于编码蛋白质的核酸序列b)的5'上游。启动子的最重要的特性是通过RNA聚合酶与至少一个DNA结合蛋白或多肽的特异性相互作用，所述DNA结合蛋白或多肽通过NRA聚合酶介导基因转录起始，并被称为转录因子。多个转录因子和/或其他蛋白质通常通过RNA聚合酶参与转录起始。因此,启动子优选是具有启动子活性的DNA序列，即，与至少一个转录因子至少瞬时结合，从而起始基因转录的DNA序列。可以通过被表达的基因的转录速率，即，通过每单位时间生成的RNA分子的数量，更特别是mRNA分子的数量，测量启动子的强度。优选地，在表达载体上，启动子序列(a)和核酸序列(b)位于彼此后方。更优选地，在核酸分子上，启动子序列(a)位于核酸序列(b)之前(按5' —3'方向)。同样优选的是，在两条核酸序列(a)和(b)之间，没有降低编码蛋白质的核酸序列(b)的转录速率的核酸序列。所有上述内容都涉及含有编码蛋白质的核酸序列(b)的DNA链(编码链)而不涉及相结合的互补DNA链。从编码蛋白质的核酸序列(b)开始，因此启动子序列(本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达载体，包含a)启动子序列，和b)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ?ID?NO.2中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ?ID?NO.4中说明的氨基酸序列至少80％相同，或与SEQ?ID?NO.6中说明的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.31 DE 102011118032.31.表达载体，包含 a)启动子序列，和 b)编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质包含信号肽和另外的氨基酸序列，并且信号肽包含与SEQ ID N0.2中说明的氨基酸序列至少80%相同，或与SEQ ID N0.4中说明的氨基酸序列至少80%相同，或与SEQ ID N0.6中说明的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列，或者信号肽包含与这些序列中的至少一个在结构上同源的氨基酸序列。2.根据权利要求1的表达载体,其中由核酸序列b)编码的信号肽具有根据SEQIDN0.2、SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.6 的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2的表达载体，其中蛋白质的另外的氨基酸序列包含酶的氨基酸序列，更特别地包含蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、鞣酸酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木糖葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、果胶切割酶、卡拉胶酶、perhydrolase、氧化酶、氧化还原酶或脂肪酶的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项的表达载体，其中信号肽排列在由核酸序列b)编码的蛋白质中的另外的氨基酸序列的N端。5.根据权利要求1至4中任一项的表达载体，其中由核酸序列b)编码的蛋白质还包含排列在蛋白质的信号肽和另外的氨基酸序列之间的连接序列，连接序列的长度特别地在I和50个氨基酸之间。6.根据权利要求1至5中任一项的表达载体，其中蛋白质的另外的氨基酸序列包含蛋白酶的氨基酸序列，所述蛋白酶的氨基酸序列 与SEQ ID N0.7至少80%相同，或 与SEQ ID N0.8至少80%相同，或 与SEQ ID N0.9至少80%相同，或 与SEQ ID N0.10至少80%相同，并在根据SEQ ID N0.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，或与SEQ ID N0.10至少80%相同，并在根据SEQ ID N0.10的编号的第99位具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，并还在根据SEQ ID N0.10的编号中具有下列氨基酸中的至少一个: (a)第3位的苏氨酸(3T)， (b)第4位的异亮氨酸(41)， (c)第61位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(61A、61T或61R)， (d)第154位的天冬氨酸或谷氨酸(154D或154E)， (e)第188...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·德格林，T·埃格特，S·埃弗斯，KH·莫勒，J·邦盖尔茨，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：
国别省市：
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