肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，属于体外诊断试剂技术领域，解决现有技术灵敏度较低、反应时间较长、成本高等技术问题。试剂盒包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液。R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；本发明专利技术采用双抗体夹心法的原理，利用亲和素‑偶联标记物体系，以及采用化学发光标记物进行化学发光，大大提高了试剂盒的检测灵敏度，减少反应时间，降低试剂成本，可用于血清/血浆中的肌红蛋白含量的定量检测。

Chemiluminescence quantitative detection kit for myoglobin and its preparation method and detection method

【技术实现步骤摘要】
肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术涉及体外诊断试剂
，尤其涉及一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
抹香鲸肌红蛋白三级结构于1960年由Kendrew用X线衍射法阐明，这是世界上第一个被描述的蛋白质三级结构。肌红蛋白(MYO)是一种细胞内结合氧血红素蛋白，普遍存在于心肌和骨骼肌中，分子量为17,800道尔顿。在急性心肌损伤时，MYO最先被释放入血液中，在症状出现约2-3小时后，血中MYO可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。因此，测定血清或血浆肌红蛋白可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标，具有良好的临床诊断价值，可用于评估潜在的急性心肌梗塞病症，并辅助诊断急性心肌梗塞，还可用于再梗死的诊断，结合临床，如MYO重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。目前用于检测肌红蛋白的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法(ELISA法)和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，具有操作简单，试剂稳定性长等特点，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。目前市售的肌红蛋白检测试剂盒主要分为以下2种：一是ELISA方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株肌红蛋白抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株肌红蛋白抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中肌红蛋白的浓度；二是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株肌红蛋白抗体标记生物素，另一株肌红蛋白抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-肌红蛋白抗体-肌红蛋白-肌红蛋白抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。以上定量检测肌红蛋白的方法存在一下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板作为固定性，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器昂贵。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，提供一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，具有检测灵敏度高，特异性好，操作简单等优点。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，R1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.02％～1％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是0.05～3μm，浓度为10mg/ml；R2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1-1:20；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.2μg/ml。R3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1-1:20；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml；优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，R1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.072％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是3μm，浓度为10mg/ml；R2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为0.4μg/ml。R3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:5；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为1.4μg/ml；优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，R1的制备方法为：取磁微粒，用20mMPB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素所述的质量比添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mMPB缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mMPB缓冲液清洗3次，用20mMPB缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，R2的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mMPB缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mMPB缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与偶联标记物的摩尔比进行添加偶联标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，R3的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mMPB缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mMPB缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与化学发光标记物的摩尔比添加化学发光标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。优选的技术方案中，上述的化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌，优选为吖啶酯。优选的技术方案中，上述的偶联标记物为生物素。优选的技术方案中，上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，还包括七个浓度的校准品和两个浓度的质控品，校准品中含有肌红蛋白的浓度分别为0ng/ml、10±1ng/ml、50±5ng/ml、100±10ng/ml、300±30ng/ml、600±60ng/ml及1200±120ng/ml；高浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为650±65ng/ml，低浓度质控品中含有铁蛋白的浓度为160±16ng/ml，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、pH值为6.5的缓冲液。上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，还包括清洗缓冲液、酸性激发液和碱性激发液。其中，清洗缓冲液包括50g/L磷酸氢二钠、10g/L磷酸二氢钠、100g/LNaCl、2％的Triton-100和2％的Proclin-300；酸性激发液为过氧化氢和硝酸水溶液，过氧化氢的质量浓度为1～2％，硝酸的摩尔浓度为6～8mM；碱性激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.3～0.4M。本专利技术还提供了上述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1、制备试剂R1，R1的制备方法为：取磁微粒，用20mMPB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素所述的质量比添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mMPB缓冲液清洗3次，加入封闭液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，R1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.02％～1％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是0.05～3μm，浓度为10mg/ml；R2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1‑1:20；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.2μg/ml。R3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1‑1:20；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，R1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.02％～1％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是0.05～3μm，浓度为10mg/ml；R2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1-1:20；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.2μg/ml。R3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1-1:20；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为≥0.7μg/ml。2.根据权利要求1所述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：R1：含有链霉亲和素包被的磁微粒的缓冲液；R2：含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；R3：含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的缓冲液；其中，R1中链霉亲和素磁颗粒质量百分比为0.072％；链霉亲和素包被的磁微粒的粒径是3μm；R2中肌红蛋白单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3；化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为0.4μg/ml。R3中肌红蛋白单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:5；偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的浓度为1.4μg/ml。3.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，R1的制备方法为：取磁微粒，用20mMPB缓冲液清洗3次，然后稀释至10mg/ml，按照磁微粒与链霉亲和素所述的质量比添加链霉亲和素，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mMPB缓冲液清洗3次，加入封闭液，37℃孵育18-24h后，置于磁分离架上分离磁珠，去上清，用20mMPB缓冲液清洗3次，用20mMPB缓冲液稀释至10mg/ml，2-8℃保存备用，得到含有链霉亲和素包被的磁微粒的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。4.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，R2的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mMPB缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mMPB缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与化学发光标记物的摩尔比添加化学发光标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有化学发光标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。5.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，R3的制备方法为：取肌红蛋白单克隆抗体，用20mMPB缓冲液置换肌红蛋白单克隆抗体保存液，用20mMPB缓冲液稀释至1mg/ml，按照抗体与偶联标记物的摩尔比进行添加偶联标记物，37℃孵育2-4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2-4h，最后对蛋白进行纯化，得到含有偶联标记物标记的肌红蛋白单克隆抗体的液体试剂；所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：韩美玉，王立英，孙成艳，高威，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22