检测T7RNA聚合酶活性的方法技术

本发明专利技术提供一种检测T7RNA聚合酶活性的方法，所述方法为利用T7RNA聚合酶催化合成含有pepper的RNA链，将RNA链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算待测T7RNA聚合酶的活性。本方法检测T7RNA聚合酶活性方便快捷且精准度高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
检测T7 RNA聚合酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及检测T7 RNA聚合酶活性的方法。

技术介绍

[0002]T7 RNA聚合酶，(T7 RNA Polymerase)是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'
→
3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA或双链DNA模板链互补的RNA。T7 RNA Polymerase可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T7启动子有高度的特异性。T7是启动子(T7 promoter)，来自T7噬菌体，能够对T7 RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，是启动T7噬菌体基因转录的一段序列。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。
[0003]Pepper序列为RNA分子片段，可高度特异结合不发光的染料分子，进而产生强烈荧光。这些荧光RNA的颜色与辣椒类似，它们具有蓝绿色、黄色、橙色及红色等不同颜色，因此被命名为Pepper。进一步的结果表明，Pepper是以单体且非G四链体的结构形式与染料分子结合，且有着纳摩尔级的高亲和力，高温度稳定性、强pH耐受性，以及对外源序列融合插入的高度兼容性。Pepper的这些优良性质使得它在细胞中的荧光亮度、激活倍数要比现有的最好的拟荧光蛋白RNA高出至少一个数量级，亲和力与稳定性高出两到三个数量级
[0004]虽然荧光原位杂交技术，或是酶反应催化的RNA化学共价标记技术均可用来标记RNA，但这些技术目前只能用于固定化细胞亦即死细胞的研究，不适合对活细胞内RNA进行分析。近期，关于利用Pepper研究RNA的技术正在兴起，但是如何利用Pepper序列研究酶的活性尚未出现相关报道。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测T7 RNA聚合酶活性的方法，提供了一种全新的检测方法。
[0006]本专利技术的一方面提供了T7 RNA聚合酶活性的检测方法，所述方法为利用T7 RNA聚合酶催化合成含有Pepper的RNA链，将RNA链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算T7RNA聚合酶的活性。
[0007]荧光染料可以与pepper序列特异性结合，产生荧光，通过检测荧光的强度，检测合成的pepper的量，生产pepper的量又与T7 RNA聚合酶的活性成正比，进而可以判定T7 RNA聚合酶的活性。
[0008]进一步地，所述荧光染料为HBC。例如HBC530。
[0009]进一步地，所述pepper的核苷酸序列为CCAATCGTGGCGTGTCGGCCTGCTTCGGCAGGCACTGGCGCCG。
[0010]进一步地，所述合成RNA链使用的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步地，所述方法具体为：
[0012](1)以含有T7启动子和pepper的引物DNA进行双引物退火,得到的产物作为模板；
[0013](2)将退火产物，在A/U/C/GTP存在的条件下被T7 RNA聚合酶转录,转录合成带有pepper的RNA链；
[0014](3)以T7 RNA聚合酶活力的log值为横坐标,荧光强度为纵坐标,用做非线性回归曲线并计算EC50；即可计算T7 RNA聚合酶活力。
[0015]进一步地，所述退火的条件如表2。
[0016]进一步地，所述转录程序时间为30～60min，温度为30～45℃。
[0017]进一步地，所述方法具体为：
[0018](1)以含有T7启动子和pepper的引物DNA进行双引物退火,得到的产物作为模板；
[0019](2)将退火产物，在A/U/C/GTP存在的条件下被T7 RNA聚合酶转录,转录合成带有pepper的RNA链；
[0020](3)以标准样本T7 RNA聚合酶活力的ln值为横坐标，荧光强度为纵坐标，添加指数趋势线，得到指数函数，以此作为标准曲线，将待测样本测试得到荧光值代入标准曲线中，进行计算酶活力。
[0021]进一步地，所述转录程序时间为30～60min，温度为30～45℃。
[0022]本专利技术的另一方面提供了一种用于检测T7 RNA聚合酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含转录程序所需的一般反应试剂，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物，以及荧光染料。
[0023]进一步地，所述荧光染料为HBC，例如HBC530。
[0024]进一步地，所述试剂盒中含有转录程序所需的一般反应试剂，例如rNTP、10
×
T7 RNA Polymerase Buffer、DTT。
[0025]如上所述，本专利技术的检测T7 RNA聚合酶活性的方法，具有以下有益效果：
[0026]本方法操作简单、周期短且成本低，同时具备高灵敏度和准确性,对于实现T7RNA聚合酶活性的高通量、自动化检测具有重要意义
附图说明
[0027]图1显示为实施例2中的Log质量浓度
‑
荧光强度曲线。
[0028]图2显示为实施例3中的Log质量浓度
‑
荧光强度曲线。
[0029]图3显示为实施例4中的标准曲线。
具体实施方式
[0030]采用同位素法测定酶的活力，同位素发容易产生发射性污染，对检测设备要求高，操作成本高，难以实现高通量。
[0031]本研究思路：带有T7启动子序列和Pepper序列的双引物退火产物，在A/U/C/GTP存在的条件下被T7 RNA聚合酶转录，转录合成带有Pepper的RNA链，RNA链与染料HBC530结合发出荧光，其荧光强度和RNA链的产量成正比，又因为RNA链的产量与T7 RNA聚合酶的活性
正相关,因此T7 RNA聚合酶的活性可以用Pepper的荧光强度来进行测定。
[0032]HBC((4
‑
((2
‑
羟乙基)(甲基)氨基)
‑
亚苄基)
‑
氰基苯乙腈)是基于绿色荧光蛋白GFP的荧光团HBI(4
‑
羟基亚苄基咪唑啉酮)开发的一种染料配体。通用SELEX(指数富集的配体系统进化)技术体外筛选得到的Pepper适配体可以特异地结合HBC并激活其荧光。
[0033]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测T7 RNA聚合酶活性的方法，所述方法为利用T7 RNA聚合酶催化合成含有pepper的RNA链，将RNA链与荧光染料结合，通过检测荧光强度计算T7 RNA聚合酶的活性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光染料为HBC。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述pepper的核苷酸序列为CCAATCGTGGCGTGTCGGCCTGCTTCGGCAGGCACTGGCGCCG。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述合成RNA链使用的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：(1)以含有T7启动子和pepper的引物DNA进行双引物退火,得到的产物作为模板；(2)将退火产物，在A/U/C/GTP存在的条件下被T7 RNA聚合酶转录,转录合成带有pepper的RNA链；(3)以T7 RNA聚合酶活力的log值为横坐标,荧光强度为纵坐标,用做非线性回归曲线，即可判定T7...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，杨菁，唐双，蔡元，
申请(专利权)人：常州福洛森医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：