一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法技术

本发明专利技术涉及一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法。该方法是以丙氨酸

【技术实现步骤摘要】
一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法


[0001]本专利技术涉及一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法，属于酶分析检测

技术背景
[0002]糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)锚定蛋白在真核细胞中普遍存在，蛋白质通过GPI分子锚定在细胞膜上，在各种生命活动中发挥着重要作用，包括细胞识别、信号转导、补体调节、抗原呈递、胚胎发育等生理过程，以及HIV等微生物感染、癌细胞侵袭和转移等病理过程，并且在人癌细胞上的表达水平异常升高，是潜在的肿瘤监测和治疗的生物标志物。尽管GPI锚定蛋白具有重要的生物学功能，但GPI锚定蛋白的研究和应用十分困难，主要限制因素之一是GPI锚结构复杂、生物合成途径繁琐，难以从天然来源纯化获得均一的GPI锚定蛋白。在天然GPI蛋白的生物合成过程中，蛋白质偶联上GPI锚是通过GPI转酰胺酶的转肽作用实现的，该酶是实现GPI锚定蛋白体外合成的理想酶源，理论上能以天然GPI蛋白前体为底物，通过转肽作用偶联GPI锚，不引入任何非天然序列，真正获得天然GPI锚定蛋白，因而GPI转酰胺酶的研究具有重要意义。
[0003]目前报道的GPI转酰胺酶体外活性测定方法有两种。一种方法是通过HeLa细胞分离获得含有GPI转酰胺酶复合物的微粒体，通过微粒体辅助无细胞表达体系表达GPI蛋白前体，在亲核剂如肼存在时，酶复合体能切除GPI蛋白前体信号序列导致蛋白底物分子量变小，进而通过SDS
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PAGE检测两个蛋白的分子量差异可定性分析GPI转酰胺酶活性。另一种方法是人工合成一种四肽底物(S
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V
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L
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N
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素)，C端偶连了香豆素荧光基团，将GPI转酰胺酶与荧光底物孵育，由于酶能水解底物释放荧光基团，可以通过测定荧光的释放，定量分析GPI转酰胺酶活性。尽管这两种方法都可以分析GPI转酰胺酶活性，但均存在一定局限性，第一种方法存在操作复杂、实验条件要求高的问题；第二种方法中的四肽底物S
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V
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L
‑
N
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素疏水系数为3.7，难溶于水，在缓冲液体系中很容易析出，导致反应体系构建困难。因而迫切需要寻找新的GPI转酰胺酶的酶活测定方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法。本专利技术的技术要点是人工设计并固相合成一种新的多肽底物A
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T
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K
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D
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素，使用该底物进行GPI转酰胺酶活性测定。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法，是以丙氨酸
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苏氨酸
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赖氨酸
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天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素为底物，使用待测GPI转酰胺酶水解该底物，测定荧光强度，然后根据7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素标准品的线性关系回归方程计算待测GPI转酰胺酶的相应酶活。
[0007]所述线性关系回归方程为：
[0008]y＝22764.61619x
‑
7696.92465，R2＝0.99903；
[0009]其中，x为7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度；
[0010]y为7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的荧光强度；
[0011]根据GPI转酰胺酶的酶解产物的荧光强度计算出7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度，再根据7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度计算出GPI转酰胺酶的酶活。
[0012]根据本专利技术优选的，所述丙氨酸
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苏氨酸
‑
赖氨酸
‑
天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素按照如下方法制备得到：
[0013]取2
‑
氯三苯甲基氯树脂加入二氯甲烷进行溶胀处理，然后加入化学剂脱除树脂原有的Fmoc保护基团，用Kaiser法检测Fmoc是否脱除完全，若脱除完全树脂应显蓝色；在处理后的树脂中加入Fmoc保护的氨基酸和其他试剂进行反应，反应完成后洗涤树脂，再用Kaiser法监测反应，树脂不显色表明缩合完成；然后重复上述步骤添加Fmoc保护的新的氨基酸，所添加的氨基酸依次为Fmoc
‑
Ala、Fmoc
‑
Thr、Fmoc
‑
Lys，直至最后一个Fmoc保护的C端修饰有7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的氨基酸Asp添加完成，将多肽从树脂上分离，得到多肽底物丙氨酸
‑
苏氨酸
‑
赖氨酸
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天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素(多肽底物A
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T
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K
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D
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素)。
[0014]根据本专利技术优选的，所述GPI转酰胺酶来自于锥虫、酿酒酵母或墨西哥利什曼原虫；
[0015]进一步优选的，所述GPI转酰胺酶GPI8亚基的基因序列如GenBank No.AJ439686.1、GenBank No.NM_001180639.1或GenBank No.AJ242865.1所示。
[0016]根据本专利技术优选的，所述GPI转酰胺酶的酶活测定方法，具体包括步骤如下：
[0017](1)将7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素标准品配制成梯度浓度为1、2、3、4、5、6μM的溶液，依次取100μL溶液通过酶标仪测定荧光强度，绘制标准曲线；
[0018]所述标准曲线的线性关系回归方程为：y＝22764.61619x
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7696.92465，R2＝0.99903；其中，x为7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度；y为7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的荧光强度；
[0019](2)向丙氨酸
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苏氨酸
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赖氨酸
‑
天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素中加入待测GPI转酰胺酶，构建GPI转酰胺酶反应体系；然后在30℃下反应15min，加入有机溶剂终止反应，然后通过酶标仪测定酶解产物的荧光强度，带入上述线性关系回归方程，计算待测GPI转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GPI转酰胺酶的酶活测定方法，其特征在于，是以丙氨酸
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苏氨酸
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赖氨酸
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天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素为底物，使用待测GPI转酰胺酶水解该底物，测定荧光强度，然后根据7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素标准品的线性关系回归方程计算待测GPI转酰胺酶的相应酶活；所述线性关系回归方程为：y＝22764.61619x
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7696.92465，R2＝0.99903；其中，x为7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度；y为7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的荧光强度；根据GPI转酰胺酶的酶解产物的荧光强度推算出7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度，再根据7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度计算出GPI转酰胺酶的酶活。2.如权利要求1所述的GPI转酰胺酶的酶活测定方法，其特征在于，所述丙氨酸
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苏氨酸
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赖氨酸
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天冬氨酸
‑7‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素按照如下方法制备得到：取2
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氯三苯甲基氯树脂加入二氯甲烷进行溶胀处理，然后加入化学剂脱除树脂原有的Fmoc保护基团，用Kaiser法检测Fmoc是否脱除完全，若脱除完全树脂应显蓝色；在处理后的树脂中加入Fmoc保护的氨基酸和其他试剂进行反应，反应完成后洗涤树脂，再用Kaiser法监测反应，树脂不显色表明缩合完成；然后重复上述步骤添加Fmoc保护的新的氨基酸，所添加的氨基酸依次为Fmoc
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Ala、Fmoc
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Thr、Fmoc
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Lys，直至最后一个Fmoc保护的C端修饰有7
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氨基
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甲基香豆素的氨基酸Asp添加完成，将多肽从树脂上分离，得到多肽底物丙氨酸
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苏氨酸
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赖氨酸
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢丽丽，段飞宇，张敬文，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：