聚合酶反应性催化核酸纳米结构制造技术

本发明专利技术涉及对聚合酶活性有反应的信号传导催化核酸纳米结构、其使用方法、包含其的装置和试剂盒。更具体地，本发明专利技术提供了一种催化信号传导纳米结构，其包含DNA酶/RNA酶如G

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚合酶反应性催化核酸纳米结构


[0001]本专利技术涉及对聚合酶活性有反应的信号传导催化核酸纳米结构、其使用方法、包含其的装置和试剂盒。更具体地，本专利技术提供了一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的敏感的催化信号传导纳米结构，所述刺激反应元件可以在集成电路中单独使用或与可将分子信号转化为聚合酶活性的靶标识别纳米结构配对使用。

技术介绍

[0002]核酸的检测在例如诊断中具有广泛的应用。已在临床实验室中越来越多地采用核酸技术以提供有关感染的前所未有的分子信息[Niemz,A.,Ferguson,T.M.和Boyle,D.S.Trends Biotechnol 29:240
‑
250(2011)；Nong,R.Y.,等人,Expert Rev Proteomics 9:21
‑
32(2012)；Zumla,A.等人Lancet Infect Dis 14:1123
‑
1135(2014)]。
[0003]当前对病原体核酸的检测几乎仅在大型集中式临床实验室中进行。这种有限的成就源于与常规技术相关的高复杂性和成本。商业测定主要利用了聚合酶链式反应(PCR)来扩增和检测特定的DNA靶标。此类系统不仅需要大型专用设备来进行PCR热循环和荧光测量，而且还需要经过培训的人员操作它。已经开发出先进的等温扩增测定法来减轻仪器对温度循环的需求，但是，这些测定法有其自身的局限性。例如，环介导的等温扩增(LAMP)具有严格的序列要求并且不易推广[Zhao,Y.等人,Chem Rev 115:12491
‑
12545(2015)]。重要的是，与其他核酸扩增方法一样，LAMP易于产生假阳性(例如，来自引物二聚体形成)。可替代地，可以使用序列特异性信号传导探针(例如荧光Taqman报告物)来提高检测准确性；然而，这些探针昂贵且用法复杂[Gardner,S.N.等人,J Clin Microbiol 41:2417
‑
2427(2003)]。由于每段DNA靶标在靶标扩增过程中的偶联信号传导都需要专用的序列特异性探针，因此所述方法变得成本越来越高，并且难以进行多重化或执行复杂计算[Juskowiak,B.Anal Bioanal Chem 399:3157
‑
3176(2011)]。
[0004]需要一种改进的分子平台以实现对核酸和其他靶分子的快速、可视化和模块化检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及反应性催化核酸纳米结构。这些结构可以被制成对聚合酶活性以及各种其他刺激和靶标有反应。所述结构的核心包含DNA酶/RNA酶以及不同的刺激反应元件，所述DNA酶/RNA酶是能够进行特定化学反应的催化核酸。作为例子，本专利技术人设计并开发了纳米结构以并入G
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四链体Hemin DNA酶和聚合酶反应元件，并证明了所述结构对于生成多模式读数的性能和兼容性。通过并入可将分子信号转换为聚合酶活性的独立反应元件，所述系统测量不同的分子靶标和/或其组合，并在不同的环境条件下显示出稳健的性能。本专利技术提供了一种用于信号传导的新型催化纳米结构，其具有改进的敏感性、得到结果的速度和稳健性。
[0006]在第一方面，提供了一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的催化核酸纳米结构。
应理解，在本专利技术中存在许多已知的可用于信号传导的DNA酶/RNA酶。
[0007]在一些实施方案中，所述DNA酶/RNA酶可以选自：
[0008]核糖核酸酶，如核糖核酸酶8
‑
17、核糖核酸酶10
‑
23或Dz10
‑
66脱氧核酶；
[0009]脱氧核糖核酸酶，如10MD5脱氧核酶或9NL27脱氧核酶；
[0010]过氧化物酶，如G
‑
四链体Hemin；
[0011]具有连接活性的酶，如E47脱氧核酶；
[0012]磷酸酶，如14WM9脱氧核酶；
[0013]酰胺水解物，如AmideAm1脱氧核酶；以及
[0014]RNA分支酶，如9F7脱氧核酶或7S11脱氧核酶。
[0015]在优选的实施方案中，所述DNA酶/RNA酶是G
‑
四链体Hemin DNA酶，优选地，所述G
‑
四链体Hemin DNA酶包含以下核苷酸序列：
[0016]5’‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
‑3’
(SEQ ID NO:1)。
[0017]在一些实施方案中，所述刺激反应元件包含在存在聚合酶的情况下抑制DNA酶/RNA酶活性的聚合酶反应元件。
[0018]在一些实施方案中，所述聚合酶反应元件缺乏发夹结构。在优选的实施方案中，所述聚合酶反应元件包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列：
[0019]5'
‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGC
‑
3'(SEQ ID NO:2)
[0020]5’‑
GCTATCGACAATGCGTT
‑3’
(SEQ ID NO:3)。
[0021]在一些实施方案中，所述聚合酶反应元件具有内部发夹结构。
[0022]在一些实施方案中，所述信号传导纳米结构的聚合酶反应元件或自引发部分包含以下核酸序列：
[0023]5’‑
AACGCATTGTCGATAGCTCAGCTGTCTGAGCTATCGACAATGCGTT
‑3’
(SEQ ID NO:10)。
[0024]在一些实施方案中，所述催化核酸纳米结构包含G
‑
四链体Hemin DNA酶并且包含选自以下的核酸序列：
[0025]5’‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTT
‑3’
(SEQ ID NO:4)；
[0026]5’‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCAT
‑3’
(SEQ ID NO:5)；
[0027]5’‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCC
‑3’
(SEQ ID NO:6)；
[0028]5’‑
CTGGGAGGGAGGGAGGGAATGCTAACGCATTGTCGATAGCTCTGTCGCTATCGACAATGCGTTAGCATCCCTCCC
‑3’
(SEQ ID NO:7)；
[0029]5’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含DNA酶/RNA酶和刺激反应元件的催化核酸纳米结构。2.根据权利要求1所述的催化核酸纳米结构，其中所述DNA酶/RNA酶选自：核糖核酸酶，如核糖核酸酶8
‑
17、核糖核酸酶10
‑
23或Dz10
‑
66脱氧核酶；脱氧核糖核酸酶，如10MD5脱氧核酶或9NL27脱氧核酶；过氧化物酶，如G
‑
四链体Hemin；具有连接活性的酶，如E47脱氧核酶；磷酸酶，如14WM9脱氧核酶；酰胺水解物，如AmideAm1脱氧核酶；以及RNA分支酶，如9F7脱氧核酶或7S11脱氧核酶。3.根据权利要求1或2所述的催化核酸纳米结构，其中所述刺激反应元件包含在存在聚合酶的情况下抑制所述DNA酶/RNA酶活性的聚合酶反应元件。4.根据权利要求3所述的催化核酸纳米结构，其中所述聚合酶反应元件具有内部发夹结构。5.根据权利要求4所述的催化核酸纳米结构，其中所述聚合酶反应元件的聚合酶延伸消除催化活性。6.根据权利要求1至5中任一项所述的催化核酸纳米结构，其中所述DNA酶/RNA酶活性是过氧化物酶活性。7.根据权利要求6所述的催化核酸纳米结构，其中通过不同的方式检测过氧化物酶底物的活性，所述方式包括但不限于比色、荧光、电化学或发光手段。8.一种检测测试样品中聚合酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供测试样品；(b)提供包含根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构的组合物；(c)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下使a)中的所述样品与b)中的所述组合物接触；(d)检测信号显影，其中信号的强度与所述样品中聚合酶活性的量相反。9.一种检测样品中的靶分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供测试样品；(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含适于识别所述样品中的所述靶分子的DNA聚合酶特异性DNA适体；(c)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述反向体寡核苷酸的一部分互补并且与其形成双链体的至少10个核苷酸的突出端区段，其中所述反向体寡核苷酸适于以比所述可变双链体区更高的亲和力识别所述样品中的所述靶分子；(d)使所述测试样品与(b)或(c)的所述组合物接触，其中所述靶分子结合至：(i)(b)中的所述适体的识别序列区促进稳定的适体
‑
DNA聚合酶复合物的形成，从而抑制DNA聚合酶活性；或者(ii)(c)中的所述反向体寡核苷酸使所述识别纳米结构不稳定，从而使所述DNA聚合酶从所述DNA适体的抑制中释放出来；
(e)提供根据权利要求3至7中任一项所述的催化核酸纳米结构；(f)在存在DNA酶/RNA酶底物和任选的信号显影试剂的情况下接触来自步骤(b)或(c)的所述纳米结构；(g)检测信号显影，其中信号强度指示：(i)当使用组合物(b)时，所述样品中存在靶分子；或(ii)当使用组合物(c)时，所述样品中不存在靶分子。10.一种检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含核酸的样品；(b)提供包含至少一种DNA聚合酶和至少一种识别纳米结构的组合物，其中所述识别纳米结构包含具有保守序列区和可变序列区的DNA聚合酶特异性DNA适体，其中所述可变序列区包含与所述样品中的靶核酸互补的至少10个核...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵慧琳，陈渊，N，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：