【技术实现步骤摘要】
本申请涉及抗体药物领域，更具体涉及igm抗体领域。
技术介绍
1、igm抗体是在免疫系统接触免疫原后最早表达的抗体，在自然状态下igm抗体在人体内以五聚体或者六聚体形式存在。传统的igg只有两个臂，而igm有10个臂或12个臂可以与靶抗原结合，额外的结合位点提供了卓越的结合能力和更高的亲和力。但是，igm由于分子量巨大而在制造和应用上存在很大的挑战性。
2、与六聚体形式的igm不同的是，五聚体形式的igm抗体包含一个稳定抗体结构的j链，该链的主要功能是通过和聚合免疫球蛋白受体(pigr)相互作用从而将igm抗体转运到黏膜表面。因此，开发含有j链的重组igm抗体的五聚体，发挥其黏膜免疫的作用，在相关呼吸道疾病的预防和治疗中具有潜在的应用价值。
3、纳米抗体(nanobody)是仅由重链可变区组成的单域抗体，也称为重链单域抗体vhh(variabledomain of heavy chain of heavy-chain-only antibody)。与常规单克隆抗体相比，纳米抗体具有生产成本较低，容易表达，人源化简单，亲和力高，稳定性强，可溶性好等优点。基于所述特点，纳米抗体作为治疗性药物已备受关注。2019年fda批准ablynx公司自主研发的卡普赛珠单抗用于治疗成人获得性血栓性血小板减少性紫癜(attp)，是首个获批上市的纳米抗体药物。在此之后，更多基于vhh的治疗方法被推进到临床试验中，充分发挥其小体积的优势。
4、本领域仍然需要商业化生产上更简便、更稳定且igm抗体五聚体表达产量更高的i
技术实现思路
1、基于igm抗体卓越的结合能力，专利技术人在针对呼吸系统疾病的研究中成功生产了一种重组igm五聚体抗体，其具有广谱的结合性能。同时，专利技术人还发现，利用哺乳动物细胞表达重组igm时，表达产物会同时出现五聚体和六聚体形式，且在igm五聚体和六聚体的活性分析中发现五聚体活性更优。由于igm抗体六聚体形式很难从产物中除去，为了商业化大规模生产有效抗体，能够正确、高效、高质量、更高表达量且更高比率地制备igm抗体五聚体至关重要。
2、此外，与原核表达相比，cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等哺乳动物细胞的蛋白表达水平低，细胞大规模培养成本高，因此设计并优化表达方法是提高目的蛋白表达量的重要途径之一。
3、专利技术人意外地发现，通过控制融合蛋白(重链或h链)与j链蛋白的表达强度，可以更高质量、更高表达量且更高比率地制备igm五聚体。
4、一方面，本专利技术提供一种生产由融合蛋白和j链蛋白形成的igm抗体的方法，所述融合蛋白包含fc片段，所述方法包括：
5、1)提供用于表达所述融合蛋白和所述j链蛋白的表达载体；
6、2)通过所述表达载体在细胞中表达所述融合蛋白和所述j链蛋白；和
7、3)产生igm抗体的五聚体；
8、其中所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述j链蛋白的表达强度。
9、在一些实施方案中，融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白，纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和fc片段，纳米抗体和fc片段可任选地通过连接基连接。
10、在一些实施方案中，用于表达融合蛋白和j链蛋白的表达载体包括：分别表达融合蛋白和j链蛋白的两个或更多个表达载体、表达融合蛋白和j链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
11、在一些实施方案中，用于表达融合蛋白和j链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和j链蛋白表达单元，所述表达单元包括启动子、目的基因(例如，融合蛋白和j链蛋白的编码序列)和任选存在的表达调控元件。
12、在一些实施方案中，融合蛋白和/或j链蛋白的n端连接有信号肽。
13、在一些实施方案中，表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。
14、在一些实施方案中，fc片段是人源igm的fc片段。
15、在一些实施方案中，j链蛋白是人源igm的j链蛋白。
16、在一些实施方案中，融合蛋白和j链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。
17、另一方面，本专利技术提供融合蛋白和j链蛋白共表达在制备其形成的igm抗体中的应用，所述融合蛋白包含fc片段，所述融合蛋白和所述j链蛋白通过用于表达所述融合蛋白和所述j链蛋白的表达载体在细胞中表达，其中，所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述j链蛋白的表达强度。
18、在一些实施方案中，融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白，纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和fc片段，纳米抗体和fc片段可任选地通过连接基连接。
19、在一些实施方案中，用于表达融合蛋白和j链蛋白的表达载体包括：分别表达融合蛋白和j链蛋白的两个或更多个表达载体、表达融合蛋白和j链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合。
20、在一些实施方案中，用于表达融合蛋白和j链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和j链蛋白表达单元，所述表达单元包括启动子、目的基因和任选存在的表达调控元件。
21、在一些实施方案中，融合蛋白和/或j链蛋白的n端连接有信号肽。
22、在一些实施方案中，表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达。
23、在一些实施方案中，fc片段是人源igm的fc片段。
24、在一些实施方案中，j链蛋白是人源igm的j链蛋白。
25、在一些实施方案中，融合蛋白和j链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1。
26、在再一方面，本专利技术提供用于本专利技术的方法或应用的表达载体，其包含融合蛋白表达单元和j链蛋白表达单元，其中融合蛋白的表达强度等于或者高于j链蛋白的表达强度。
27、在又一方面，本专利技术提供一种转化的或者转染的细胞，其包含本专利技术所述的表达载体或者包含本专利技术所述的表达载体包含的融合蛋白表达单元和j链蛋白表达单元。
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1.一种生产由融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的方法，所述融合蛋白包含Fc片段，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，所述纳米抗体和Fc片段可任选地通过连接基连接；并且
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括：分别表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的两个或更多个表达载体、表达所述融合蛋白和所述J链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合；
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述用于表达所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元，所述表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件；
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述融合蛋白和/或所述J链蛋白的N端连接有信号肽；
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中表达载体在细胞中表达包括稳转表达和瞬转表达；
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述Fc片段是
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述J链蛋白是人源IgM的J链蛋白；并且
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白和所述J链蛋白的表达强度之比为约1:1至约10:1、约1:1至约9:1、约1:1至约8:1、约1:1至约7:1、约1:1至约6:1、约1:1至约5:1、约1:1至约4:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1；
10.用于权利要求1-9中任一项所述的方法的表达载体，其包含融合蛋白表达单元和J链蛋白表达单元，其中所述融合蛋白的表达强度等于或者高于所述J链蛋白的表达强度。
...【技术特征摘要】
1.一种生产由融合蛋白和j链蛋白形成的igm抗体的方法，所述融合蛋白包含fc片段，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白选自纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和fc片段，所述纳米抗体和fc片段可任选地通过连接基连接；并且
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述用于表达所述融合蛋白和所述j链蛋白的表达载体包括：分别表达所述融合蛋白和所述j链蛋白的两个或更多个表达载体、表达所述融合蛋白和所述j链蛋白两者的单个表达载体、或它们的组合；
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述用于表达所述融合蛋白和所述j链蛋白的表达载体包括融合蛋白表达单元和j链蛋白表达单元，所述表达单元包括启动子、目的基因、终止子和任选存在的表达调控元件；
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述融合蛋白和/或所...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇思念，陈明键，李澍，杨继，刘春，郜培杰，李莹，戴新悦，
申请(专利权)人：北京东方略生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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