同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片制造技术

本发明专利技术涉及同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片。本发明专利技术仅用100μl脑脊液即可实现多种疱疹病毒、肠道病毒核酸同时提取、扩增和检测，所需样本量少，提取快捷，扩增效率高，结果可靠，特异性强，可以实现对上述病毒引起的临床病毒性脑炎、脑膜炎的早期诊断和治疗，解决了目前临床脑脊液中病毒检测的瓶颈问题。

【技术实现步骤摘要】
同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片
本专利技术涉及同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，属于分子生物学
。
技术介绍
病毒性脑炎、脑膜炎是由病毒感染引起的以中枢神经系统(CNS)损害为主的传染病，常见的病毒主要包括疱疹病毒科的单纯疱疹病毒I型和2型(HSV1和HSV2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)、人类疱疹病毒6型(HHV6)和7型(HHV7)以及引起手足口病的肠道病毒(EVs)如肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和柯萨奇B组5型(CoxB5)等。由单纯疱疹病毒引起的单纯疱疹病毒脑炎是散发性脑炎及脑膜炎最常见的病原体，若不及时用无环鸟苷进行抗病毒治疗，则死亡率可高达70%.而近年亚洲地区流行的手足口病，规模呈上升趋势，并发重症CNS感染而导致死亡的病例也逐渐增多，可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性脊髓灰质炎样麻痹、脑脊髓炎、神经源性肺水肿，甚至导致死亡，重症存活患者常伴有神经系统后遗症。由于不同的病毒感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，缺乏特异性，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，而且敏感性和特异性很差，远远不能满足临床要求，严重滞后于临床治疗；而组织学和免疫学检测方法需要在疾病中后期取材才可能得到阳性结果，由此延误治疗造成该类疾病的死亡率居高不下或病后严重的后遗症，对人民身体健康和生命质量造成严重危害。 分子生物学技术的发展为解决这一难题提供了条件，PCR是一种简便和快速的体外DNA扩增技术，是以样本中的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，特异性地在体外扩增所需要的目的基因，以检测DNA病毒；RT-PCR技术是在PCR技术基础上建立起来的，以样本中的RNA为模板，在逆转录酶的作用下，反转录成cDNA后，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以检测RNA病毒的感染。两者因其简便、快速、灵敏、特异等优点已成为生物医学领域最有价值的研究手段和病毒学诊断的金标准。疱疹病毒为一组有包膜的DNA病毒，而包括手足口病毒在内的肠道病毒是一组正义单链RNA病毒，由于DNA病毒和RNA病毒基因组核酸提取方法及扩增程序都不同，目前所建立的检测脑脊液疱疹病毒和肠道病毒的方法仍需将DNA病毒与RNA病毒分别进行核酸提取，DNA病毒的核酸提取多采用蛋白酶K/酚-氯仿-异戊醇提取法，再将提取的DNA进行PCR扩增；RNA病毒的核酸提取多采用Trizol/氯仿-异丙醇提取法，再将提取的RNA进行RT-PCR检测。中国专利文献CN103614371A(申请号201310594174.0)公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法,该专利技术公开了一种同时提取血清、双拭子中动物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步骤:对待提取物使用异硫氰酸胍裂解液裂解；硅胶膜吸附RNA ;洗液I除去杂蛋白；洗液II洗去杂质；DEPC水洗脱核酸；上述异硫氰酸胍裂解液包括 3-7M 异硫氰酸胍、0.6% -1.0% TriTon-100,30-50mM Tris-Cl、5_15mMDTT,60-90y g/mL 蛋白酶 K、10_30mM EDTA, PH 在 4.3-4.6 ;上述洗液 I 包括 5-6M 盐酸胍，53-59%无水乙醇，Κ70-90μ g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;上述洗液II包括70-80%乙醇。该专利技术的优点在于提取过程简单、周期短、成本低、能同时提取动物血清样本、双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。 虽然上述文献公开了同时提取DNA和RNA的方法，但所含试剂多、成分复杂、操作较为繁琐，更重要的是该方法仅针对动物血清及双拭子样本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，因这些样本通常含有的RNA病毒和DNA病毒核酸浓度较高，易于提取分离，但如应用于病毒含量较低的脑脊液样本，可造成脑脊液本身低浓度的病毒丢失使结果呈现假阴性，因而不适宜脑脊液中病毒的提取。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种同时检测人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，仅通过一次提取、扩增和杂交即可同时检测出脑脊液中上述病毒的靶基因，时间仅需5.5小时。本专利技术技术方案如下:一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于:所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHVl，2，4，5-f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五种引物混合，核苷酸序列分别如下:HHV1, 2, 4, 5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；HHV1,2,5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'；HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'；EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'；EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ；其中HHVl, 2，4，5-f 为扩增 HSV1、HSV2、EBV, CMV 的上游引物；HHVl, 2，5-r 为扩增 HSV1、HSV2、CMV 的下游引物；HHV4-r为扩增EBV的下游引物；Biotin-HHVl, 2，4，5-f 和 Biotin-EV-f 为在两条上游引物 HHV1, 2，4，5-f 和 EV_f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下:[0021 ] EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ；人类疱疹病毒特异性探针序列如下:HSV1-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。根据本专利技术优选的，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下:硫氰酸胍47.264g, N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫苏糖醇15.425mg,梓檬酸钠736.25mg，糖原 IOmg, DEPC_ddH20 加至 100mL ；根据本专利技术优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下:EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'；根据本专利技术优选的，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下:5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特异性逆转录引物 0.5 μ 1，核酸模板 2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ I。逆转录试剂盒除引物外的其它试剂也可采用本领域市售产品。根据本专利技术优选的，所述的DNA与RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于：所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin‑HHV1,2,4,5‑f、HHV1,2,5‑r、HHV4‑r、Biotin‑EV‑f和EV‑r五种引物混合，核苷酸序列分别如下：HHV1,2,4,5‑f:5′‑TCATCTACGGGGACACGGAC‑3′；HHV1,2,5‑r:  5′‑CGCACCAGATCCACGCCCTT‑3′；HHV4‑r:      5′‑GAGCTCCACCCCCTTCATC‑3′；EV‑f:        5′‑TTAAAACAGCCTGTGGGTTG‑3′；EV‑r:        5′‑TGACTCATCGACCTGATCTACA‑3；其中HHV1,2,4,5‑f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物；HHV1,2,5‑r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物；HHV4‑r为扩增EBV的下游引物；Biotin‑HHV1,2,4,5‑f和Biotin‑EV‑f为在两条上游引物HHV1,2,4,5‑f和EV‑f的5’端添加生物素Biotin作为标记物；所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下：EV71‑P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA；CA16‑P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG；CB5‑P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG；人类疱疹病毒特异性探针序列如下：HSV1‑P:GGCACAGCACAAAGATGGA；HSV2‑P:GGCACAAAACGAAAATGGA；HHV3‑P:GTTTGTTATGACGGCCGAG；HHV5‑P:ACGAAAGCGGACAAACACG。...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测脑脊液中人类疱疹病毒及肠道病毒的基因芯片，包括核苷酸提取试剂盒、DNA与RNA同时逆转录试剂盒、DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒、连接有特异探针的基因芯片；其特征在于: 所述的DNA与RNA同时PCR扩增试剂盒中的引物由Biotin-HHVl, 2，4，5_f、HHVI, 2，5-r、HHV4_r、Biotin-EV-f和EV_r五种引物混合，核苷酸序列分别如下:HHVI, 2，4，5-f:5/ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3'；HHV1, 2, 5-r: 5' -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3'； HHV4-r:5' -GAGCTCCACCCCCTTCATC-3'； EV-f:5' -TTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3'； EV-r:5' -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3 ； 其中HHVI, 2，4，5-f为扩增HSV1、HSV2、EBV、CMV的上游引物； HHVI, 2，5-r为扩增HSV1、HSV2、CMV的下游引物； HHV4-r为扩增EBV的下游引物； Biotin-HHVl, 2， 4，5-f 和 Biotin-EV-f 为在两条上游引物 HHVI, 2，4，5-f 和 EV-f 的 5，端添加生物素Biotin作为标记物； 所述的特异性探针分为肠道病毒特异性探针和人类疱疹病毒特异性探针，肠道病毒特异性探针序列如下:EV71-P:GATCGTGGTTCGCTGCTTCTA ；CA16-P:CACTATTGGTCGTGATTGTACAAAG ；CB5-P:TGCCTACTATTGATCGAGGTGTATTG ； 人类疱疹病毒特异性探针序列如下:HSVl-P:GGCACAGCACAAAGATGGA ；HSV2-P:GGCACAAAACGAAAATGGA ；HHV3-P:GTTTGTTATGACGGCCGAG ；HHV5-P:ACGAAAGCGGACAAACACG。2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸提取试剂盒中的提取裂解液，每百毫升组分如下: 硫氰酸胍47.264g,N-月桂酰肌氨酸0.5g, 二硫苏糖醇15.425mg,柠檬酸钠736.25mg,糖原 10mg，DEPC-ddH20 加至 100ml。3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒中的特异性逆转录引物序列如下:EV-r:5/ -TGACTCATCGACCTGATCTACA-3'。4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述的DNA与RNA同时逆转录试剂盒，反应体系如下: 5XRT Buffer2y I, RT Enzyme Mix0.5 μ 1，2 μ M 特异性逆转录引物 0.5 μ 1，核酸模板。2 μ I，DEPC-ddH20 加至 10 μ L.5.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，段春红，马衍辉，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁儿童医院，
类型：发明
国别省市：山东;37