一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒。该引物对由上游引物和下游引物组成，序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。试剂盒包括所述引物对，还可以包括其他检测试剂。所述检测猪圆环病毒3型病毒的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物对或试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，根据熔解曲线和扩增曲线Cq值进行结果判读。本发明专利技术准确性高、特异性好、重复性好、操作简便，可以准确、快速、高效地进行鉴定PCV3，有利于在临床实践中推广应用。

Primer pair, method and kit for detecting porcine circovirus type 3 virus

The invention discloses a primer pair, a method and a kit for detecting porcine circovirus type 3 virus. The primers were composed of upstream primer and downstream primer sequences respectively, such as SEQ ID and SEQ NO:1 ID shown in NO:2. The kit includes the primer pair and may include other detection reagents. The detection of porcine circovirus type 3 virus, genome DNA with the test sample as the template, real-time fluorescence quantitative PCR reaction or kit by primers according to the melting curve and amplification curve Cq value to the interpretation of the results. The invention has the advantages of high accuracy, good specificity, good repeatability and simple operation, and can accurately, rapidly and effectively identify PCV3, so as to be popularized and applied in clinical practice.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒
本专利技术属于生物
，特别涉及一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对、方法及试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒(Procinecircovirus，PCV)是单股环状DNA病毒，基因组全长1.7kb左右，属于圆环病毒科，是最小的动物DNA病毒之一。目前已确定有两种类型的猪圆环病毒，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1对猪只没有致病性，但PCV2能在临床条件下能感染猪只并引起疾病。研究发现，猪圆环病毒主要引起仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、猪繁殖障碍症、肉芽肿性肠炎、急性肺水肿、增生性坏死肺炎、仔猪先天性震颤等。最近，一种新型的猪圆环病毒3型病毒在美国首次报道，该病毒基因组全长2.0kb，其基因编码两个主要蛋白：Cap和Rep，两者在核酸链上处于相反方向，其能引起猪皮炎肾病综合征、繁殖障碍、心脏和多系统炎症等症状。荧光定量PCR检测技术融合了PCR技术的核酸高效扩增、引物特异性高、光谱技术敏感性高和高精确定量的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量结果。SYBRGreenI是一种能与双链DNA特异结合的一种染料，当体系中模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新合成的双链上，随着PCR的进行，结合的SYBR染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号越来越强，从而达到定量的目的。荧光定量PCR技术的出现，极大简化了定量检测的过程，结果判断更真实可靠，大大提高了工作效率。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对。本专利技术的又一目的在于提供包含所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种检测猪圆环病毒3型病毒的方法。本专利技术根据参考比对GenBank中所有PCV3Rep基因序列，选择特定核苷酸序列作为扩增区域，设计了一对用于检测猪圆环病毒3型的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR引物。建立了特异、灵敏、稳定、可靠的PCV3SYBRGreenRT-qPCR检测系统，操作简单可靠，有利于疾病的及时诊断治疗。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对，由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。一种检测猪圆环病毒3型病毒的试剂盒，包括所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对。所述的试剂盒还包括荧光染料、阳性标准品、阴性对照和PCR反应液中的一种或至少两种。所述的荧光染料优选为SYBRGreenI；进一步优选为北京康润公司的RealStarGreenFastMixture(2×)。所述的PCR反应液，包括DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和稳定剂等。所述的阴性对照优选为ddH2O。所述的阳性标准品的制备方法优选为：从PCV3阳性病料中提取DNA，通过所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对进行PCR得到扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组载体，所述的重组载体即为所述的阳性标准品。所述的载体优选为pMD19-T。一种检测猪圆环病毒3型病毒的方法，包括如下步骤：(1)从待测样品中提取DNA；(2)以步骤(1)得到的DNA做为DNA模板，用所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对或试剂盒进行荧光定量PCR反应；(3)反应结束后，根据熔解曲线和扩增曲线Cq值进行结果判读：熔解曲线为单一峰，熔解温度在80.5～82.5℃之间，且扩增曲线Cq值在10.17～34.81之间判定为阳性；熔解曲线非单一峰，或熔解曲线为单一峰但熔解温度不在80.5～82.5℃范围内，判定为阴性。所述的荧光定量PCR反应的反应体系优选为20μL的反应体系：包括RealStarGreenFastMixture(2×)10μL、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、DNA模板1.0μL(即待测样品)、ddH2O7.4μL。所述的上游引物和下游引物的浓度优选为10μM。所述的上游引物和下游引物的配比优选为1:1。所述的荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性15s，56.4℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环；反应结束后先加热至95℃反应10s，然后再降至65℃，开始以0.5℃/s递增至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线。所述的引物对或试剂盒在猪圆环病毒3型病毒检测领域中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术设计并筛选得到一种猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测引物对，所述引物对的上游引物、下游引物的序列如SEQIDNO：1～2所示；利用该引物可特异性扩增出猪圆环病毒3型Rep基因的部分保守序列，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据熔解曲线和Cq值来鉴别PCV3；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别PCV3，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定PCV3，有利于在临床实践中推广应用。本专利技术对多个PCV3病毒的Rep区域基因序列(NC031753、KX458235、KY354039、KX966193、KX898030、KX778720、KT869077和KY354038)进行综合研究，针对研究所得的特定目标扩增区域进行引物设计，引物特异性较好，可以有效检测PCV3的病毒株。附图说明图1是实施例1的重组质粒pMD19-T-Rep的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为DL2000Marker(单位：bp)，泳道1为重组质粒pMD19-T-Rep。图2是实施例2的阳性标准品SYBRGreenI荧光定量PCR的标准曲线图。图3是实施例2的阳性标准品SYBRGreenI荧光定量PCR的熔解曲线图。图4是实施例3的实时荧光定量PCR灵敏性试验中结果分析图；其中，1～8的模板浓度(copies/μL)依次为1.73×109、1.73×108、1.73×107、1.73×106、1.73×105、1.73×104、1.73×103、1.73×102；NC表示阴性对照，模板为ddH2O。图5是实施例4的实时荧光定量PCR的特异性试验扩增结果分析图；其中，1表示PCV3阳性对照；2～15依次分别表示FMDV、SVDV、SVA、PEDV、PKV、PSV、PBoV、PDCoV、PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、PPV和SIV；NC表示阴性对照，模板为ddH2O。图6实施例4的时荧光定量PCR的特异性试熔解曲线结果分析图；其中，PCV3为阳性对照熔解曲线，其余分别为FMDV、SVDV、SVA、PEDV、PKV、PSV、PBoV、PDCoV、PRV、PRRSV、CSFV、PCV2、PPV、SIV和ddH2O。图7是实施例4的实时荧光定量PCR的特异性试验ddH2O(NC)和PCV3的熔解曲线图。图8是实施例4的实时荧光定量PCR的特异性试验中PKV和PCV3的熔解曲线图。图9是实施例4的实时荧光定量PCR的特异性试验SVA和PCV3的熔解曲线图。图10是实施例4的实时荧光定量PCR的特异性试验PCV2和PCV3的熔解曲线图。图11是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对，其特征在于：由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪圆环病毒3型病毒的引物对，其特征在于：由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种检测猪圆环病毒3型病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对。3.根据权利要求2所述的检测猪圆环病毒3型病毒的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括荧光染料、阳性标准品、阴性对照和PCR反应液中的一种或至少两种。4.根据权利要求3所述的检测猪圆环病毒3型病毒的试剂盒，其特征在于：所述的荧光染料为SYBRGreenI。5.根据权利要求3所述的检测猪圆环病毒3型病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性标准品通过如下方法制备得到：从PCV3阳性病料中提取DNA，通过权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对进行PCR得到扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组载体，所述的重组载体即为所述的阳性标准品。6.一种检测猪圆环病毒3型病毒的方法，包括如下步骤：(1)从待测样品中提取DNA；(2)以步骤(1)得到的DNA做为DNA模板，用权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型病毒的引物对或权利要求2～5任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，蓝天，孙媛，陈桂华，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44