本发明专利技术涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/pGEX-NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为330碱基的原核表达质粒；其是以一种重组大肠杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行病毒感染和疫苗免疫后的诊断。
【技术实现步骤摘要】
检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒
本专利技术涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒，特别是 涉及一种以表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2 在试剂盒中的应用，属于动物病毒学与动物传染病学检测
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技术介绍
副流感病毒（PIV)系单股负链RNA病毒目、副粘病毒科、副粘病毒亚科，是一类 不分节段的单股负链RNA病毒，可感染多种动物(包括人在内）。已报道的感染宿主有 人、牛、犬、禽、猴、家兔、鼠、马、羊、雪貂、虎等某些野生动物。牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3，BPIV3)是引起牛和其它反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒。 最近几年BPIV3在我国内蒙、黑龙江、山东等地普遍流行。BPIV3引起的病症为牛副流行性 感冒，又称运输热，是一种急性接触性传染病，病毒对牛的致病力不强，但在其他继发性 细菌(特别是多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（特别是长途运输中受寒、饥 饿、拥挤、气候恶劣等）的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。 同时，BPIV3和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)-起构成了牛呼吸 道综合征（Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原。目前，牛呼吸道综 合征是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界的养牛业。随着 我国加入WTO以后，畜牧产品交易频繁，该病在我国养牛业发达地区广泛流行。临床预防 和治疗中对该病还没有安全、高效的疫苗和药物，随着我国人民生活水平的提高，奶牛和肉 牛养殖业的迅猛发展，养牛成为我国农民致富的手段之一，同时国内大型养牛企业也加大 了牛养殖的投入，频繁的运输等因素使牛群发生BRDC的比率也随之上升。国外对牛群的 BRDC监测和防制一直非常重视，实行严格的检疫、建立BPIV3感染阴性种群作为防制BRDC 发生的有效措施，同时加强对健康牛群和可疑牛群的血清学监测，有针对性采取不同措施， 减少BPIV3的感染和BRDC的发生，为牛群养殖创造良好的条件。因此，对养殖群体定期进 行抗体阳性动物筛选，不断淘汰请群或者制定合适的综合防御措施，避免动物群的感染发 病，广泛而深入地开展BPIV3感染的流行病学调查，进行BPIV3检测技术的研究，研制和开 发BPIV3抗体和抗原监测试剂盒，为国内的BPIV3的防治提供技术支撑。 BPIV3的诊断目前主要依靠传统的分离病毒检测、免疫荧光检测和分子生物学检 测方法，酶联免疫吸附试验（ELISA)用于BPIV3的诊断仍处于研究阶段。由于ELISA更 适合短时间内检测大批量的血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度，发展了 ELISA、 Dot-ELISA和阻断ELISA等几种方法。ELISA方法还有方便、易操作，利于在基层兽医部门 和大型养殖区进行现地检测等优点。BPIV3 N蛋白为核衣壳蛋白（NP)，由约515个氨基酸 组成，是病毒核衣壳的主要成份。NP编码基因为病毒的保守序列。NP含有两个结构域，一 个是N端结构域，与RNA结合，高度保守；另一个是C端结构域，裸露于装配完成后的核衣壳 表面，含有对蛋白酶敏感的磷酸化位点和抗原结合位点，与负链RNA病毒基因组模板的活 性有着密切关系。BPIV3 NP的C端与BPIV3抗体具有良好的反应原性，可以用于BPIV3感 染和疫苗免疫后的诊断。因此，选择BPIV3 NP的C端保守序列，构建表达工程菌株，用表达 的重组蛋白作为抗原，可建立检测牛副流感病毒3型抗体的间接ELISA诊断方法。 迄今为止，还没有检索到检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒的专利，特 别是核心试剂制备方法和制备该核心试剂的生物材料。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛 副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,是以一种重组大肠 杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行 病毒感染和疫苗免疫后的诊断。 本专利技术另一个目的是重组大肠杆菌菌株在制备牛副流感病毒3型抗体试剂盒中 的应用。 本专利技术的技术方案是这样实现的：一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc 蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,其特征在于：rN-C蛋白为NP基因 C'端编码区的330bp 编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因 C'端编码区为330碱基的原核表 达质粒；其具体的构建过程如下： (1) 克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段：以分离的牛副流感病毒3型基因组 为模板RNA，通过RT-PCR方法扩增得到N基因 C'端330bp片段（含可表达的330bp)，经 测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中（登录号：JQ063064)对应序列完全相同； (2) 构建原核表达载体PGEX-NP2:将牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段与克 隆载体pCR-blunt (购于Invitrogen)连接，经限制性内切酶酶切鉴定无误后，将该序列定 向插入原核表达载体pGEX-6p-l (购于宝生物工程（大连）有限公司）的及I和5?/ I 多克隆位点； (3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建：将步骤（2)所述的原 核表达载体PGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21感受态细胞（Escherichia coli BL21购自 北京全式金生物技术有限公司），经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株； (4) 牛副流感病毒3型NP的C'端片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤（3)所述的 重组大肠杆菌Escherichia coli BL2 I/ pGEX_NP2在含50mg/ml氨节青霉素（Amp)抗性 的LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-13-0半乳糖昔（IPTG)诱导，Western-blot分 析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，表达 的蛋白以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性； (5) 牛副流感病毒3型阴、阳性标准血清的制备：选择阴性健康犊牛作为免疫动物。 用制备的牛副流感病毒3型细胞培养物，灭活后与佐剂混合，分3次免疫28?35日龄的健 康牛(最后一次不加佐剂)，当ELISA检测效价达到1:600以上时，颈部动脉无菌采血，获得 的血液分离血清，即为合格的标准阳性血清。将健康阴性牛经颈动脉采血，即为标准阴性血 清。在所制备的阴、阳性标准血清中加入0.01%硫柳汞防腐，过滤除菌，无菌分装。 2、一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ PGEX-NP2在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒中的应用。 3、根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒，其特本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX‑NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391‑500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为 330碱基的原核表达质粒；其具体的构建过程如下：(1)克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA 片段:以分离的牛副流感病毒3型基因组为模板RNA，通过RT‑PCR 方法扩增得到N基因C'端330bp 片段含可表达的330bp ，将牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段与克隆载体pCR‑blunt连接，经限制性内切酶酶切鉴定后，通过测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA 序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中登录号: JQ063064 对应序列完全相同；(2) 构建原核表达载体pGEX‑NP2:将上述测序准确的克隆质粒内的牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段定向插入原核表达载体pGEX‑6p‑1的BamH I和Sal I多克隆位点之间；(3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX‑NP2的构建:将步骤(2) 所述的原核表达载体pGEX‑NP2转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株；(4) 牛副流感病毒3型NP的C'端330bp片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤(3) 所述的重组大肠杆菌BL21/ pGEX‑NP2在含50mg/ml氨苄青霉素Amp 抗性的LB 液体培养基中培养，经异丙基硫代‑ ß‑O 半乳糖昔IPTG 诱导，Western‑blot 分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，重组蛋白大小为38KD，以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有良好的免疫学活性。...
【技术特征摘要】
1. 检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc 蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp 编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为330碱基的原核表 达质粒；其具体的构建过程如下： (1) 克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段：以分离的牛副流感病毒3型基因 组为模板RNA，通过RT-PCR方法扩增得到N基因C'端330bp片段含可表达的330bp，将 牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段与克隆载体pCR-blunt连接，经限制性内切酶 酶切鉴定后，通过测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA序列与牛副流感病毒3型全基 因组在Genebank中登录号：JQ063064对应序列完全相同； (2) 构建原核表达载体PGEX-NP2:将上述测序准确的克隆质粒内的牛副流感病毒3型 NP的C'端的330bp片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-l的汉3?H I和I多克隆位点 之间； (3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建：将步骤（2)所述的原 核表达载体PGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性 重组菌株； (4) 牛副流感病毒3型NP的C'端...
【专利技术属性】
技术研发人员：王凤雪，武华，温永俊，王炜，曹丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，华威特北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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