一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，特点是在PVC底板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，该结合垫上包被有所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体一胶体金标记物，该硝酸纤维素膜上分别包被有恶臭假单胞菌超声波破碎液构成的检测线和兔抗鸡卵黄抗体构成的质控线，优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确性高。

【技术实现步骤摘要】
一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法
本专利技术涉及免疫化学检测技术，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的胶体金免疫层析技术用以快速检测环境、食品、人和动物各种组织，血液及粪便样品中恶臭假单胞菌的检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
假单胞菌属是微生物的重要类群，也是自然界分布最广泛的微生物之一。恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)属假单胞菌属(Pseudomonas)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，为革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、海水、淡水动植物体表及各种含蛋白食品中，为人或动物源性或机会致病菌。目前，国内也陆续报道了一些由恶臭假单胞菌引起的养殖鱼类和甲壳动物的疾病，如欧洲鳗(Anguillaanguilla)的烂鳃病、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)的肝肾白点病，罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的黑鳃病及三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的牛奶病等，这些疾病一旦爆发，传播迅速，死亡率高，给养殖产业造成了巨大的损失。环境中的恶臭假单胞菌也可能随食物进入肠道，在一定条件下该菌异常增殖，破坏了肠道内正常菌群的平衡而造成鱼体发病，已经成为养殖鱼类的重要病原。同时恶臭假单胞菌也是人的条件致病菌，在一定条件下攻击机体免疫力低下人群，该菌感染人体自溶后释放出内毒素可致中毒症状，多系统感染，败血症，甚至感染性休克。恶臭假单胞菌为一种人畜共患病菌，近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用，恶臭假单胞菌的感染有上升趋势，且该菌对多种抗菌药物具有较高的耐药性，因此，若能确定病因，及时对症下药，势必能给养殖产业减少损失，同时，在医学方面也具有重要意义。目前，病原体的检测方法主要有分离培养、电镜观察、PCR、ELISA、色谱分析等，这些方法多耗时耗力，需要专用场地和仪器设备，需要专业人员操作。对于恶臭假单胞菌感染，根据微生物检测标准需先对其进行增菌实验，挑选特定菌株用全自动微生物分析仪分析鉴定，整个过程操作繁琐，而且需要专业人员在无菌条件下进行，结果也需数天才能获得，不利于对病源的确定及病情的及时控制。胶体金免疫层析试验(gold-immunochromatographyassayGICA)是20世纪80年代开始发展起来的新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，基于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低等优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测各种病原和有毒有害物质的试纸条。但是，目前国内外还没有公开任何关于恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法的相关研究报道。鸡卵黄抗体即卵黄中的免疫球蛋白(immunoglobulinofyolk，IgY)，是针对特定抗原的，具有持续效价的高亲和力抗体。用鸡做宿主来产生抗特定抗原的IgY，饲养简单，无需采血，只需使用少量抗原即可产生大量抗体，从卵黄中提取的IgY纯度高、含量大。在疾病的检测、诊断方面，IgY因免疫学特性独特，动物种系发生学距离远，其特异性和针对性较哺乳动物抗体更强，应用于免疫诊断中，可减少假阳性的出现，从而提高检测的特异性，是近年来新兴的研究领域。但是，目前国内外还没有公开任何关于恶臭假单胞菌IgY的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金免疫层析技术的特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低并且操作简便的恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法，满足了现场快速检测的需求。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种恶臭假单胞菌检测试纸条，所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体(IgY)包被的质控线。所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金溶液(颗粒直径为25-50nm)按6-8μg：1mL混合，在pH5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加入加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物。一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)样品垫的制备将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的0.01MpH7.2的PBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；(2)特定包被的结合垫的制备将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的0.01MpH7.2的PBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；(3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤维膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；(4)试纸条的制备将步骤(1)得到的样品垫、步骤(2)得到的特定包被的结合垫、步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得恶臭假单胞菌检测试纸条，真空封装，4℃保存。所述的恶臭假单胞菌抗原的制备方法如下：取实验室-80℃保存的恶臭假单胞菌种，在LB固体培养基中划线活化，28℃倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mLLB液体培养基的试管中，28℃，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用LB液体培养基按1∶100稀释到三角烧瓶中，28℃，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其OD600值，当其OD600值达到0.4-0.6时停止培养。将培养的菌液在4℃进行5000rpm离心10min，弃上清，下层沉淀用pH7.2的0.01MPBS重悬洗涤，再次5000rpm离心10min，沉淀用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉淀即为恶臭假单胞菌抗原。所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：(1)抗恶臭假单胞菌卵黄抗体的制备将上述恶臭假单胞菌抗原与无菌生理盐水混合得到恶臭假单胞菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5％，然后37℃恒温水浴灭活24h，即得到灭活的恶臭假单胞菌抗原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的恶臭假单胞菌抗原和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为4×109CF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恶臭假单胞菌检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假单胞菌卵黄抗体‑胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体(IgY)包被的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体包被的质控线；所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液的包被量为1-2μL/cm；所述的兔抗鸡卵黄抗体的包被量为1-2μL/cm；所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液是将恶臭假单胞菌抗原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液；所述的试纸条的制备方法包括以下步骤：(1)样品垫的制备将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的pH7.2的0.01MPBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；(2)特定包被的结合垫的制备将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的pH7.2的0.01MPBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；(3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；(4)试纸条的制备将步骤(1)得到的样品垫、步骤(2)得到的特定包被的结合垫、步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得恶臭假单胞菌检测试纸条，真空封装，4℃保存；所述的结合垫上包被的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法具体操作如下：将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按6-8μg：1mL混合后，在pH5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％叠氮化钠的pH7.2的0.01MPBS缓冲液重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。2.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的恶臭假单胞菌抗原的制备方法如...

【专利技术属性】
技术研发人员：章礼平，李登峰，方静，刘联国，刘飞，陈梅娟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33